董 培， 李永紅， 堯 凱， 劉卓煒， 周芳堅(jiān)

(華南腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中山大學(xué)腫瘤防治中心泌尿外科，廣東 廣州 510060)

高脂肪/膽固醇等“西方飲食”同前列腺癌的發(fā)病和進(jìn)展密切相關(guān)［1］。高血清膽固醇水平能夠促進(jìn)前列腺癌的發(fā)展。然而，循證醫(yī)學(xué)證據(jù)表明，采用膽固醇合成抑制藥物如羥甲基戊二酰輔酶A(hydroxymethylglutaryl coenzyme A，HMG－CoA)還原酶抑制劑并不能降低前列腺癌整體風(fēng)險(xiǎn)率［2］，具體機(jī)制尚未明確。我們研究發(fā)現(xiàn)，低膽固醇培養(yǎng)前列腺癌PC－3細(xì)胞中prohibitin(PHB)表達(dá)升高。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建PHB基因啟動(dòng)子調(diào)控的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染前列腺癌PC－3細(xì)胞，分析其轉(zhuǎn)染活性并進(jìn)一步驗(yàn)證其膽固醇敏感活性，為進(jìn)一步研究其在膽固醇影響前列腺癌進(jìn)展的基因研究提供基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料

螢光素酶報(bào)告基因載體pGL3－Basic為Pro-mega產(chǎn)品，前列腺癌細(xì)胞系PC－3細(xì)胞為中山大學(xué)腫瘤防治中心實(shí)驗(yàn)室保存。DNA聚合酶、Xho I、Hind III和T4 DNA連接酶為New England Biolabs產(chǎn)品;脂質(zhì)Lipofectamine 2000為Invitrogen產(chǎn)品;質(zhì)粒純化試劑盒及膠回收試劑盒為Qiagen產(chǎn)品，Luciferase Assay System為Promega產(chǎn)品。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組PC－3細(xì)胞株傳代培養(yǎng)于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入10 mL DMEM+10%FBS培養(yǎng)液置于37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)組棄去培養(yǎng)液，加入12 mL DMEM+10%脂蛋白缺乏血清(lipoproteindeficient fetal bovine serum，LPDS)+50 μmol/L甲羥戊酸鹽(mevalonate)和50 μmol/L司伐他汀(simvastatin)培養(yǎng)液。繼續(xù)放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。

2.2 Real－time PCR定量檢測(cè) PHB mRNA 培養(yǎng)48 h后，Trizol一步法提取總RNA后，按說(shuō)明書操作反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)GenBank中人PHB基因序列號(hào)(NM_002634)的mRNA序列，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，運(yùn)用Oligo 6引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)。選定核苷酸號(hào)為131－305的序列，上游引物5'－GGAGGCGTGGTGAACTCTG －3'，下游引物 5'－ CTGGCACATTACGTGGTCG A G－3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為175 bp。以GAPDH為內(nèi)參照引物，上游引物 5'－TGAACGGGAAGCTCACTGG －3'，下游引物 5'－TCCACCACCCTGTTGCTGTA－3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為317 bp。反應(yīng)體系加入SYBR? Green PCR Master Mix，按照試劑盒要求配置?；旌蠘悠肪鶆蚣尤胫罙BI MicroAmp光學(xué)96孔反應(yīng)板中，蓋上蓋子密封，離心、去除氣泡。每份樣本重復(fù)3次以減小加樣誤差。在ABI PRISM 7900HT擴(kuò)增儀上設(shè)置95℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)35次，4 ℃終止反應(yīng)。基因表達(dá)結(jié)果分析運(yùn)用2－ΔΔCt法分析。

2.3 PHB基因啟動(dòng)子引物的設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)GenBank中人 PHB promoter(GenBank accession#DQ406856)的mRNA序列，運(yùn)用人17染色體基因DNA為模板參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì):正向引物 5'－GCAACTCGAGGGAGAAACCCCGTCTCTAC－3'(下劃線核苷酸部分為Xho I內(nèi)切酶位點(diǎn))，前面采取4個(gè)堿基進(jìn)行硫代修飾，反向引物 5'－GCAAAAGCTTCCTCACAAGTCGGACTCACGC －3'(下劃線核苷酸部分為Hind III內(nèi)切酶位點(diǎn))，前面采取4個(gè)堿基進(jìn)行硫代修飾。同時(shí)選擇低密度脂蛋白受體(low－density lipoprotein receptor，LDLR)為陽(yáng)性對(duì)照，根據(jù)GenBank中LDLR promoter(GenBank accession#L29401)的堿基序列，以人總?cè)旧wDNA為模板參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì):正向引物5'－CTCGAGCTTCACGGGTTAAAAGCCGATGTCACA－3'(下劃線核苷酸部分為 Xho I內(nèi)切酶 位點(diǎn))。反向引物5'－AAGCTTATTGCACTCGGGGCCCACGTCATTTA－3'(下劃線核苷酸部分為Hind III內(nèi)切酶位點(diǎn))。經(jīng)過(guò)BLAST軟件進(jìn)行序列同源性分析，確認(rèn)靶向基因的特異性后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。引物由北京奧科生物技術(shù)公司合成。

2.4 PCR擴(kuò)增及鑒定 采用Platinum Pfx DNA polymerase(Invitrogen)PCR反應(yīng)體系，按照試劑盒要求配置。要求配置94℃預(yù)變性2 min，94℃ 15 s，55℃ 30 s，68 ℃ 1 min/kb，循環(huán) 35次，72 ℃10 min，4℃終止反應(yīng)。合成產(chǎn)物用基因序列測(cè)序證實(shí)，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定產(chǎn)物的濃度及純度并紀(jì)錄。

2.5 pGL3重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用Xho I和Hind III內(nèi)切酶雙酶切 PCR產(chǎn)物，得到PHB－Pro、LDLR－Pro和pGL3－Basic載體，凝膠電泳后從凝膠中提取純化DNA，回收的片段用T4 DNA連接酶16℃連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在Amp抗性平板上篩選重組質(zhì)粒。用SacⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定并送公司DNA測(cè)序。測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pPHB－1192、pLDLR－234。

2.6 重組質(zhì)粒的活性分析 分別將pPHB－1192、pLDLR－234及陰性對(duì)照質(zhì)粒pGL3－Basic轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞系PC－3，以未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞為未轉(zhuǎn)染對(duì)照組(NM)，同步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48 h后，更換細(xì)胞培養(yǎng)液為普通培養(yǎng)基對(duì)照組、低膽固醇培養(yǎng)基+膽固醇組(低膽固醇培養(yǎng)基+10 mg/L膽固醇+1 mg/L 25－羥基膽固醇(LPDS+CHO)和低膽固醇培養(yǎng)基組(LPDS)。繼續(xù)放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。裂解細(xì)胞，加入螢光素酶檢測(cè)試劑，Luminometer Model(Promega)上每孔自動(dòng)加入100 μL Luciferase Assay Reagent檢測(cè)螢光值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 低膽固醇對(duì)PC－3細(xì)胞PHB mRNA表達(dá)的影響

在低膽固醇培養(yǎng)條件下，PC－3細(xì)胞內(nèi)的PHB表達(dá)明顯上調(diào)，與對(duì)照組相比較有顯著差異(P＜0.01)，見(jiàn)圖 1。

Figure 1.Expression of PHB mRNA increased after CDM treatment.＊＊P ＜ 0.01 vs NM control group.圖1 CDM誘導(dǎo)PC－3細(xì)胞PHB mRNA表達(dá)

2 重組質(zhì)粒pPHB－1192和pLDLR－234的鑒定

經(jīng)Xho I和Hind III雙酶切后分別可見(jiàn)到大小約全長(zhǎng)為1192 bp和234 bp的PHB－Pro和LDLRPro基因片段，約6000 bp處可見(jiàn)pGL3－Basic片段，結(jié)果與設(shè)計(jì)相符，測(cè)序結(jié)果與目的基因組一致，見(jiàn)圖2。

Figure 2.Gel electrophoresis result after plasmid was digested by Xho I and Hind III.M:DNA marker.圖2 雙酶切后電泳結(jié)果

3 重組質(zhì)粒螢光素酶活性分析

螢光檢測(cè)結(jié)果顯示，同空白對(duì)照組pGL3比較，實(shí)驗(yàn)組pPHB－1192 luciferase表達(dá)顯著增強(qiáng)，兩組比較有顯著差異(P＜0.05)，表明轉(zhuǎn)染效率高。同普通培養(yǎng)基組相比較，低膽固醇培養(yǎng)基組luciferase表達(dá)顯著升高，兩組比較有顯著差異(P＜0.05)。在低膽固醇培養(yǎng)基組中加入膽固醇，其luciferase表達(dá)顯著降低，兩組比較有顯著差異(P＜0.05)，表明低膽固醇誘導(dǎo)PHB在PC－3細(xì)胞中表達(dá)，見(jiàn)表1。

表1 重組質(zhì)粒在不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的PC－3細(xì)胞中螢光素酶表達(dá)的比較Table 1.Comparison of luciferase expression of recombinant plasmids in PC－3 cells cultured in different media(.n=3)

表1 重組質(zhì)粒在不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的PC－3細(xì)胞中螢光素酶表達(dá)的比較Table 1.Comparison of luciferase expression of recombinant plasmids in PC－3 cells cultured in different media(.n=3)

*P ＜0.05 vs LPDS in the same group.

Group LPDS LPDS+CHO NM pGL3 1 1 1 pLDLR －234 9.182 ±0.596 3.208 ±0.276* 4.001 ±0.369*pPHB －1192 70.057 ±2.109 33.615 ±4.063* 39.253 ±2.183*

討 論

研究發(fā)現(xiàn)，肥胖和多種疾病進(jìn)展有關(guān)，進(jìn)展期的前列腺癌膽固醇升高，高脂肪/膽固醇等“西方飲食”同前列腺癌的發(fā)病和進(jìn)展密切相關(guān)［3］。尚未清楚為什么高膽固醇可改變信號(hào)分子和導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增生，目前研究表明是腫瘤細(xì)胞膜上的膽固醇變化導(dǎo)致固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element－binding protein，SREBP)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，使前列腺癌表現(xiàn)出更強(qiáng)的侵襲性。細(xì)胞保持膽固醇的動(dòng)態(tài)平衡的能力在很大程度上受到SREBP轉(zhuǎn)錄因子控制。這些SREBP由3個(gè)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子組成:SREBP－1a、SREBP－1c、SREBP－2。SREBP－1a和 SREBP－1c定位于染色體17q11.2，由SREBP－1基因的不同啟動(dòng)子編碼產(chǎn)生。SREBP－1a主要調(diào)控膽固醇和脂肪酸合酶，如HMG－CoA以及甘油三酯代謝的LDLR的基因轉(zhuǎn)錄;SREBP－1c選擇調(diào)控脂肪酸、甘油三酯。SREBP－2定位于22q13，主要調(diào)控膽固醇合成的甲羥戊酸基因如法呢基焦磷酸合酶和HMG－CoA還原酶［4］。

Heemers等［5］使用2個(gè)獨(dú)立的前列腺癌細(xì)胞系(LNCaP和MDA–Pca－2a)并且給予雄激素刺激，證實(shí)了在雄激素依賴的前列腺癌細(xì)胞系中普遍存在受雄激素協(xié)調(diào)刺激的LDLR和HMG－CoA表達(dá)，并且包括了SREBP途徑活化作用。Ettinger等［6］通過(guò)對(duì)前列腺癌LNCaP異種移植的裸鼠腫瘤模型研究發(fā)現(xiàn)，去勢(shì)后SREBP－1a、－1c和－2呈中等程度升高。在雄激素抵抗期(第21－28 d)，SREBP－1a和1c表達(dá)較去勢(shì)前顯著升高。雄激素刺激導(dǎo)致固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白裂解激活蛋白(SREBP cleavageactivating protein，SCAP)增加。SCAP水平升高增加成熟SREBP產(chǎn)生和刺激脂肪生成基因表達(dá)。SCAP在去勢(shì)治療后降低而在雄激素抵抗期顯著升高。Montgomery等［7］分別對(duì)于人體原位及轉(zhuǎn)移前列腺癌及裸鼠移植的前列腺癌標(biāo)本進(jìn)行研究證實(shí)，雄激素抵抗的前列腺癌組織內(nèi)的類固醇生成酶如FASN、CYP17A1、HSD3B1、HSD17B3、CYP19A1 和 UGT2B17均高于原位前列腺癌。

PHB基因是一種有效的腫瘤抑制基因，因其具有明顯的抗細(xì)胞增殖、抗腫瘤作用而得名。PHB能抑制細(xì)胞增殖，這種作用是細(xì)胞周期特異性的，主要在G期－S期之間發(fā)揮檢查點(diǎn)的作用，抑制核轉(zhuǎn)錄因子E2F的轉(zhuǎn)錄活性，調(diào)控Ras－MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，對(duì)于細(xì)胞生存至關(guān)重要［8］。PHB作為雄激素信號(hào)的目標(biāo)蛋白，能夠抑制雄激素受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄和雄激素依賴的前列腺癌細(xì)胞增殖。Gamble等［9］研究發(fā)現(xiàn)在雄激素刺激增殖的前列腺癌LNCaP細(xì)胞中PHB表達(dá)下調(diào)超過(guò)50%，過(guò)度表達(dá)PHB抑制雄激素刺激的LNCaP細(xì)胞增殖，而抑制其表達(dá)則促進(jìn)細(xì)胞增殖，提示PHB具有調(diào)控前列腺癌細(xì)胞增殖作用。此后研究證實(shí)，PHB作為雄激素受體(androgen receptor，AR)的核共遏制物，可能在前列腺癌進(jìn)展為雄激素非依賴過(guò)程中發(fā)揮作用［10］。

研究發(fā)現(xiàn)，低氧條件下小鼠肝細(xì)胞膜和線粒體PHB水平依次增加，提示其在細(xì)胞感受外界環(huán)境氧變化、相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及低氧時(shí)細(xì)胞內(nèi)的調(diào)節(jié)機(jī)制中發(fā)揮保護(hù)作用［11］。另外，PHB能夠抑制E2F介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，從而保護(hù)人RAMOS B淋巴細(xì)胞免受DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑喜樹堿誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［12］。在雌激素拮抗劑治療的乳腺癌細(xì)胞中同樣發(fā)現(xiàn)，PHB和共阻遏物 Brg1/Brm的高表達(dá)，PHB與E2F1和p53共定位到細(xì)胞核并能增強(qiáng)E2F1和p53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)［13］，從而發(fā)揮抗凋亡作用。這些研究表明，PHB通過(guò)抑制E2F介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用，從而使腫瘤細(xì)胞逃避雌激素拮抗劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致激素非依賴性進(jìn)展。

本研究以前列腺PC－3細(xì)胞為細(xì)胞模型，采用real－time PCR證實(shí)，在普通培養(yǎng)基中PC－3細(xì)胞中PHB mRNA低水平正常表達(dá)，在膽固醇缺乏條件作用48 h后，PHB表達(dá)顯著上調(diào)。克隆PHB啟動(dòng)子基因片段并構(gòu)建轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，并以LDLR啟動(dòng)子質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果表明，PHB啟動(dòng)子質(zhì)粒在前列腺癌PC－3細(xì)胞中顯示出良好的轉(zhuǎn)錄活性，且在低膽固醇培養(yǎng)細(xì)胞中顯著表達(dá)上調(diào)。PHB上調(diào)抑制腫瘤細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞逃避抗腫瘤藥物和不良因素導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，這可能是前列腺癌內(nèi)分泌治療有限、雄激素抵抗進(jìn)展的重要原因之一。

由于本實(shí)驗(yàn)僅在體外檢測(cè)了前列腺癌雄激素非依賴PC－3細(xì)胞中PHB表達(dá)情況，下一步實(shí)驗(yàn)需要對(duì)多種前列腺癌細(xì)胞株進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)一步分析PHB中膽固醇敏感作用位點(diǎn)，同時(shí)需模擬體內(nèi)環(huán)境，構(gòu)建實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，為理解前列腺癌發(fā)生、發(fā)展和臨床前列腺癌治療和預(yù)防提供理論依據(jù)。

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