張化宇， 唐 寅， 常 青， 劉 璐，王宇輝， 蔣孟茜， 韓迎春， 祁 榮△， 劉國慶△

(北京大學(xué)1心血管研究所，2分子心血管學(xué)教育部重點實驗室，3病理學(xué)系，北京 100191)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是由于胰腺分泌的消化酶自我消化胰腺及其周圍組織而導(dǎo)致的嚴重的急性炎癥反應(yīng)，并可能繼發(fā)一系列的多器官功能障礙，是臨床上危急重癥中較難治療的疾病之一［1］。

雨蛙肽(caerulein)是膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)的類似物，小鼠腹腔過量給予雨蛙肽刺激，可以引起類似于人類急性胰腺炎疾病時的生化及病理生理改變。因此，雨蛙肽誘導(dǎo)的急性胰腺炎小鼠模型對臨床研究急性胰腺炎的發(fā)病機制、病理過程、診斷及藥物干預(yù)治療效果等方面有重要意義［2，3］。近年來，用于雨蛙肽誘導(dǎo)的急性胰腺炎模型小鼠的品系主要涉及 C57BL/6J［4，5］、BALB/c［6，7］和 ICR［8，9］3種。然而，多項研究報告有不同的結(jié)果，表明不同品系的小鼠對雨蛙肽誘發(fā)的胰腺炎可能有不同的敏感性，但目前尚缺乏對這種品系間差異的系統(tǒng)研究。而實際上，小鼠品系的差別在疾病模型制備中是非常重要的。動脈硬化［10－12］、肥胖和糖尿?。?3，14］等均如此。本研究以血液生化學(xué)、胰腺病理學(xué)和胰腺炎性因子表達水平為指標，研究C57BL/6J、BALB/c和ICR 3種不同品系的小鼠對雨蛙肽誘導(dǎo)的急性胰腺炎易感性的差異。

材料和方法

1 動物

2月齡雌性C57BL/6J、BALB/c和ICR小鼠，體重約20 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物部提供。所有小鼠均在12 h光照、12 h黑暗的標準周期下，于無菌設(shè)備中飼養(yǎng)，自由進食及飲水。實驗方案經(jīng)北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物倫理管理委員會批準。

2 主要試劑

Caerulein和DEPC購自 Sigma。α淀粉酶和脂肪酶測定試劑盒購自北京中生北控生物科技股份有限公司。動物組織總RNA Trizol提取液購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。Reverse Transcript Kit購自Fermentas。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

3 主要方法

3.1 急性胰腺炎小鼠模型 C57BL/6J、BALB/c和ICR 3種品系的小鼠各12只，隨機分為2組，即實驗組(n=6)與對照組(n=6)。各組小鼠自由飲水條件下禁食12 h。實驗組小鼠腹腔注射caerulein的生理鹽水溶液(50 μg/kg)，每小時1次，連續(xù)注射7次。對照組小鼠同法腹腔注射生理鹽水。于第1次腹腔注射后的 0、3、6、9、12、24 h，對各組小鼠分別進行眶靜脈取血，肝素抗凝，離心分離血漿，試劑盒測定血漿淀粉酶和脂肪酶活性。第1次注射24 h后處死小鼠，取胰腺組織，分別用于病理學(xué)及炎癥因子表達的研究。

3.2 胰腺組織病理學(xué)評分 對24 h取得的各組小鼠胰腺組織進行福爾馬林緩沖液固定、石蠟包埋和切片。切片進行 HE染色。按照病理學(xué)評分標準［15，16］(表 1)，對各胰腺組織的切片進行雙人、雙盲的病理評分。對評分結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。

表1 胰腺炎癥損傷病理評分標準Table 1.The standards of pathological scoring to the injury extent of pancreas

3.3 胰腺組織炎癥因子表達測定 取小鼠胰腺組織約50 mg，于2 mL RNA Trizol提取液中勻漿，提取胰腺組織總RNA。利用Fermentas Reverse Transcript試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。實時定量PCR(real－time quantitative PCR)測定各胰腺組織中的 IL－1、IL－6、IL－10、TNF－α 和TGF－β1炎癥因子mRNA表達水平。每個樣品重復(fù)3次，并以SYBR Green作為熒光劑，結(jié)果以18S rRNA的表達水平標準化。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 血漿淀粉酶和脂肪酶的變化

實驗組和對照組小鼠在誘導(dǎo)急性胰腺炎的0、3、6、9、12和24 h的血漿淀粉酶和脂肪酶活性見圖1。與對照組正常小鼠相比，實驗組小鼠在雨蛙肽誘導(dǎo)急性胰腺炎后，其血漿淀粉酶和脂肪酶水平均有明顯升高，并在9－12h達到峰值。3種品系的實驗組小鼠在誘導(dǎo)急性胰腺炎后，BALB/c和ICR小鼠的血漿淀粉酶水平較C57BL/6J小鼠有更顯著的升高，見圖1A;BALB/c小鼠的脂肪酶峰值水平顯著高于C57BL/6J和ICR小鼠，見圖1B。以上結(jié)果表明，BALB/c和ICR小鼠在雨蛙肽誘導(dǎo)急性胰腺炎后，其血漿生化學(xué)指標(淀粉酶和脂肪酶)較C57BL/6J小鼠有更顯著的改變。

Figure 1.Plasma α － amylase and lipase activity of C57BL/6J，BALB/c and ICR mice.BALB/c and ICR mice showed more dramatic increase of plasma α－amylase activity(A)and lipase activity(B)than those in C57BL/6J mice.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs C57BL/6J mice;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs ICR mice.圖1 C57BL/6J、BALB/c和ICR小鼠血漿淀粉酶和脂肪酶的活性測定

2 胰腺病理學(xué)變化

3種品系小鼠的胰腺病理切片見圖2。與對照組相比，實驗組小鼠的胰腺均有明顯的水腫改變。胰腺組織顯示小葉間隙增寬、結(jié)構(gòu)紊亂，腺泡細胞局限性或廣泛性壞死，小葉間及壞死灶內(nèi)均有大量炎性細胞浸潤，見圖2A;而對照組小鼠胰腺形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)完好，無炎癥改變，見圖2A。

Figure 2.Morphology and pathological scores of pancreatic tissues.A:HE staining of the pancreatic tissues(×200，scale bar 100 μm)from control and AP － induced groups of each mouse strain.Compared with the integrated and normal morphology in control groups，representative sections from AP－induced groups showed obvious pathological changes.B:pathological severity evaluation of the pancreatic tissues in terms of edema，inflammation cells，hemorrhage and necrosis.Pathological scoring was determined according to the standards described in Table 1.C:total pathological scores of the pancreatic tissues from each mouse strain.Compared with BALB/c and ICR mice，the pancreata of C57BL/6J mice showed milder pathological changes after AP induction.*P ＜ 0.05，＊＊ P ＜0.01 vs C57BL/6J mice;#P ＜0.05 vs BALB/c mice.圖2 胰腺組織病理形態(tài)學(xué)研究及病理評分

對C57BL/6J、BALB/c和ICR實驗組小鼠的胰腺切片進行病理評分，結(jié)果顯示，BALB/c小鼠胰腺的炎癥細胞浸潤在3種品系的小鼠中最為嚴重，見圖2B;BALB/c和ICR小鼠胰腺的水腫程度顯著高于C57BL/6J小鼠，見圖2B。對水腫、壞死、炎細胞浸潤和出血4個指標進行總評分，C57BL/6J小鼠的病理總評分顯著低于BALB/c和ICR小鼠，見圖2C。結(jié)果表明，在雨蛙肽誘導(dǎo)急性胰腺炎情況下，C57BL/6J小鼠胰腺病理形態(tài)學(xué)的改變較BALB/c和ICR小鼠更輕。

3 胰腺組織炎癥因子mRNA表達水平的定量比較

我們對3種品系的實驗組小鼠胰腺組織中的炎癥因子IL－1β、IL－6、IL－10、TNF－α 和 TGF－β1mRNA的表達水平進行定量分析，以評估其胰腺局部炎癥的嚴重程度。結(jié)果如圖3所示:ICR小鼠胰腺組織中的促炎因子IL－1β表達顯著高于C57BL/6J和BALB/c小鼠，見圖3A;TNF－α表達水平從高到低分別為ICR＞BALB/c＞C57BL/6J，見圖3D;IL－6、TGF－β1以及炎癥抑制因子IL－10表達水平在3種品系的小鼠間無顯著差異，見圖3B－E。結(jié)果表明，在雨蛙肽誘導(dǎo)的急性胰腺炎的病程中，C57BL/6J小鼠的炎癥因子表達水平較ICR和BALB/c小鼠低。

Figure 3.The expression of inflammatory factors in pancreatic tissues after AP induction.Total RNA was isolated from 50 mg pancreatic tissues，and the expression of IL－1β，IL－6，IL－10，TNF－α and TGF－β1was quantified by real－time PCR with SYBR Green.The results were normalized by‘housekeeping’18S rRNA.The expression of IL－1β and TNF－α in the pancreata of ICR mice was more higher than that in BALB/c and C57 BL/6J mice，and BALB/c mice also showed higher TNF － α expression than C57BL/6J mice.*P ＜0.05 vs C57BL/6J;#P ＜0.05 vs BALB/c mice.圖3 胰腺組織炎癥因子表達水平

討 論

急性胰腺炎是臨床危重病癥之一，但在疾病的診斷和治療上仍缺乏有效手段。目前，血漿淀粉酶和脂肪酶水平仍是臨床上常用的診斷胰腺炎及其嚴重程度的特異性指標;胰腺的病理形態(tài)學(xué)改變也為胰腺炎的診斷和治療提供更為直接有力的證據(jù)。

本研究通過采用雨蛙肽對 C57BL/6J、BALB/c和ICR 3種不同品系的小鼠誘導(dǎo)急性胰腺炎，表明小鼠品系的差異對急性胰腺炎造模效果有明顯影響。其中，BALB/c小鼠的血漿酶學(xué)指標、胰腺病理學(xué)改變及TNF－α表達水平方面顯著高于C57BL/6J小鼠;而ICR小鼠在急性胰腺炎誘導(dǎo)中的血漿淀粉酶水平和IL－1β、TNF－α表達水平顯著高于C57BL/6J小鼠。因此，與其它 2種品系的小鼠相比，C57BL/6J小鼠在急性期血漿胰腺酶學(xué)指標、胰腺病理學(xué)改變及胰腺組織炎癥因子表達水平上，都顯示了對雨蛙肽誘導(dǎo)的急性胰腺炎較低的敏感性。

正是基于對急性胰腺炎小鼠模型的研究，人們對急性胰腺炎的病理改變特征和炎癥因子表達上調(diào)、氧自由基損傷及鈣離子內(nèi)流異常等機制方面有了更深入的了解。我們的研究將為急性胰腺炎疾病的臨床診斷、治療和研究提供幫助。

此外，對于急性胰腺炎易感因素及其機制的研究還有賴于基因修飾小鼠。在建立基因修飾小鼠模型時，小鼠品系的選擇也至關(guān)重要。常用于代謝實驗研究的C57BL/6J小鼠，因其對雨蛙肽誘發(fā)的胰腺炎易感性較低，可用于研究胰腺炎的促進因子;而BALB/c、ICR小鼠的高易感性，將對研究胰腺炎的保護因素有價值。我們的研究結(jié)果將為急性胰腺炎研究中基因修飾小鼠的模型建立時如何選擇合適的小鼠品系提供理論支持。

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