姚宇鋒， 賴(lài)婭娜， 陳環(huán)球

惡性黑色素瘤(Maligant Melanoma，MM)是指來(lái)源于神經(jīng)嵴的黑色素細(xì)胞在免疫缺陷、遺傳因素及多種理化因素等影響下惡變而形成的一種惡性腫瘤。是一種高度惡性腫瘤，對(duì)放化療不敏感，手術(shù)治療是其主要治療手段。近年來(lái)用樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DC)疫苗治療晚期惡性黑色素瘤的研究甚多［1-2］，但是國(guó)內(nèi)外尚缺少DC疫苗治療無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的可根治手術(shù)MM的資料。為此，我們對(duì)2008年1月至2009年12月我科收治的12例肢體MM患者根治術(shù)后進(jìn)行負(fù)載腫瘤細(xì)胞抗原的DC疫苗治療，并與同期30例未接受DC疫苗治療的肢體MM患者進(jìn)行比較分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究共納入42例進(jìn)展期(Ⅱ、Ⅲ期)肢體MM患者，男22例，女20例，年齡33～67歲，中位年齡56.8歲。42例患者均行根治性手術(shù)治療并經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為MM，影像學(xué)檢查排除遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，KPS≥60分;血常規(guī)、肝腎功能、心肺功能基本正常。其中12例簽署知情同意書(shū)接受常規(guī)免疫治療聯(lián)合DC疫苗治療，其余30例患者僅接受常規(guī)免疫治療。

1.2 方法

1.2.1 熱休克凋亡MM細(xì)胞抗原負(fù)載的DC疫苗的制備和回輸 按參考文獻(xiàn)［3］方法進(jìn)行DC疫苗的制備。按參考文獻(xiàn)［4］方法進(jìn)行DC疫苗的回輸，每周注射1次，劑量為4×106細(xì)胞/次，共注射4次，部分患者注射5～8次。注射前按2005版《中華人民共和國(guó)藥典》第三部規(guī)定的方法進(jìn)行無(wú)菌和內(nèi)毒素檢測(cè)合格。

1.2.2 治療方法 常規(guī)組術(shù)后只接受IL-2/IFNα-2b治療方案。IL-2 200萬(wàn)U肌肉注射，qod;IFNα-2b 300萬(wàn)U肌肉注射，qod;1個(gè)月為1個(gè)療程。IL-2及IFNα-2b間隔應(yīng)用。治療組在行上述方案治療的進(jìn)行DC疫苗注射，方法和劑量同前。

1.2.3 免疫學(xué)指標(biāo)觀察 分別在DC疫苗治療前和結(jié)束1周后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血 CD3+、CD4+、CD8+等T淋巴細(xì)胞亞群、自然殺傷(nature kill，NK)細(xì)胞的比率及 IFN-γ+CD8+T細(xì)胞數(shù)量［5］，ELISA試劑盒(晶美生物工程有限公司)檢測(cè)血清 IL-2、IL-10、IL-12、TNF-α 和 IFN-γ 的水平。DTH試驗(yàn):DC免疫治療結(jié)束1周時(shí)進(jìn)行DTH(delayed type hypersensitivity)試驗(yàn)，用l mL青霉素試驗(yàn)注射器吸取0.2 mL制備好的DC懸液，于一側(cè)上肢前臂內(nèi)側(cè)行皮內(nèi)注射，同時(shí)在對(duì)側(cè)前臂內(nèi)側(cè)皮內(nèi)注射0.2 mL生理鹽水作為對(duì)照。注射后48～72 h內(nèi)通知患者觀察注射部位有無(wú)紅腫及硬，直徑大于5mm者判斷為DTH試驗(yàn)陽(yáng)性。

1.2.4 安全性評(píng)價(jià) 在DC輸注后30min及24 h觀察局部及全身急性毒性反應(yīng)并作及時(shí)處理，直至毒性反應(yīng)消失或接受其他治療。整個(gè)治療過(guò)程中參照國(guó)家規(guī)定的《抗腫瘤藥物急性與亞急性毒性反應(yīng)分度級(jí)標(biāo)準(zhǔn)》觀察患者是否出現(xiàn)不良反應(yīng)并且動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)患者血液細(xì)胞學(xué)和肝腎功能變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 免疫指標(biāo)變化

聯(lián)合DC治療組在DC免疫治療后外周血CD3+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+及 NK 細(xì)胞比率較治療前明顯升高(P＜0.05)，且明顯高于常規(guī)治療組(P＜0.05)(表1);同時(shí)DC治療后患者血清IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α 水平均較治療前及常規(guī)治療組顯著上升(P＜0.05)(表2)。另外對(duì)常規(guī)免疫治療聯(lián)合DC組12例患者進(jìn)行了IFN-γ+CD8+細(xì)胞檢測(cè)和DTH試驗(yàn)，7例患者治療后IFN-γ+CD8+T細(xì)胞數(shù)量升高2倍以上，其中5例治療后DTH試驗(yàn)呈陽(yáng)性反應(yīng)。

2.2 不良反應(yīng)

表1 兩組治療前后T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞比率的變化(x ± s，%)

表2 兩組治療前后細(xì)胞因子的變化(±s，pg/mL)

表2 兩組治療前后細(xì)胞因子的變化(±s，pg/mL)

a:與DC治療前比較，P＜0.05;b:與常規(guī)組治療后比較，P＜0.05

常規(guī)治療組常規(guī)治療聯(lián)合DC組指標(biāo)治療前 治療后IL-2 33.86 ±14.34 38.38 ±13.23 34.13 ±12.61 54.86 ±16.43ab IL-10 41.78 ±13.27 43.82 ±12.35 42.87 ±13.64 44.96 ±16.32 IL-12 24.54 ±6.82 32.82 ±6.59 22.80 ±5.53 73.90 ±15.68ab IFN-γ 45.73 ±13.27 49.82 ±12.35 45.87 ±13.64 69.96 ±16.32ab TNF-α 21.07 ±6.63 22.74 ±6.59 21.80 ±5.53 75.90 ±15.63治療前 治療后ab

常規(guī)治療聯(lián)合DC組的12例患者，皮下注射后30 min內(nèi)均未出現(xiàn)惡心、嘔吐、頭痛、寒戰(zhàn)、高熱等不良反應(yīng)，3例患者在整個(gè)疫苗治療過(guò)程中出現(xiàn)低熱反應(yīng)，未予特殊處理后恢復(fù)，4例患者出現(xiàn)注射局部紅腫、硬結(jié)，給予對(duì)癥處理后，紅腫消失、局部硬結(jié)未出現(xiàn)擴(kuò)大現(xiàn)象。所有患者均未出現(xiàn)嚴(yán)重的血液細(xì)胞學(xué)、肝腎功能的變化。上述結(jié)果顯示DC疫苗注射是安全的，無(wú)明顯毒副作用。

3 討論

目前手術(shù)治療仍是治療MM最行之有效的方法。由于MM對(duì)放療、化療不敏感，病死率仍很高。近年來(lái)，生物治療在惡性腫瘤治療中的應(yīng)用技術(shù)日趨成熟，如白介素-2(IL-2)，干擾素(IFN)等。而DC免疫治療在惡性黑色素瘤治療中的應(yīng)用也越來(lái)越受到人們的重視。影響DC免疫治療的因素很多，其中與MM臨床預(yù)后有關(guān)的一個(gè)重要因素就是DC負(fù)載的腫瘤抗原［6］。DC疫苗的抗原負(fù)載體系有多種不同形式，如單個(gè)腫瘤抗原肽、混合腫瘤抗原多肽、腫瘤細(xì)胞裂解液、腫瘤細(xì)胞核酸等。與上述抗原制備方式不同的是，本研究采用熱休克方式誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，制備自體腫瘤抗原。由于熱休克可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞高表達(dá)熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)，DC表面表達(dá)多種HSP受體(如CD91，CD40，TLR2/4或LOX1)，通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制將使DC高效地?cái)z取 HSPs-多肽復(fù)合物抗原，用富含HSPs的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行抗原負(fù)載可提升DC疫苗的效率［7］。本研究采用熱休克凋亡的自體腫瘤細(xì)胞制備抗原，在避免腫瘤抗原缺失造成免疫逃避的同時(shí)提高DC疫苗的免疫原性，研究其治療MM的臨床應(yīng)用價(jià)值。

外周血 中 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+比例、NK細(xì)胞比率的變化是反映人體特異性和非特異性免疫功能的重要指標(biāo)，其中CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+比例反映機(jī)體特異性免疫功能，NK細(xì)胞反映機(jī)體非特異性細(xì)胞免疫功能。本研究發(fā)現(xiàn)，12例患者在經(jīng)過(guò)DC 疫苗治療后 CD3+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+及NK細(xì)胞比率明顯升高，說(shuō)明DC疫苗治療能夠提高M(jìn)M患者的特異性和非特異性免疫功能，對(duì)于增強(qiáng)患者術(shù)后的抗腫瘤功能具有重要意義。

IL-2、IL-12、IFN-γ 和 TNF-α 在機(jī)體抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用，如 IL-2、IL-12刺激 NK細(xì)胞或CTL的殺瘤活性，IFN-γ具有較強(qiáng)的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，TNF-α可直接造成腫瘤細(xì)胞的凋亡，其中IL-2、IL-12 和 IFN-γ 均為 Thl細(xì)胞直接分泌［7］。腫瘤患者手術(shù)前后都可出現(xiàn)Thl反應(yīng)向Th2的漂移(Th1/Th2 漂移)，機(jī)體出現(xiàn) Thl弱勢(shì)［8-9］，使機(jī)體的免疫功能進(jìn)一步降低。本研究顯示自體DC免疫治療后，Th1 類(lèi)細(xì)胞因子 IL-2、IL-12、IFN-γ 和 TNF-α的水平明顯升高，而Th2型細(xì)胞因子IL-10的變化沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示DC疫苗能誘導(dǎo)增強(qiáng)體內(nèi)抗腫瘤細(xì)胞免疫，可激發(fā)腫瘤患者的Th1型免疫反應(yīng)，有利于殘余微小病灶的清除。有文獻(xiàn)報(bào)道DC免疫治療后DTH陽(yáng)性及特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答與患者的生存期有一定的相關(guān)性［10］。在本研究中，12例常規(guī)治療聯(lián)合DC組患者有7例患者治療后IFN-γ+CD8+T細(xì)胞數(shù)量升高2倍以上，其中5例患者治療后DTH試驗(yàn)呈陽(yáng)性反應(yīng)。

毒副作用的觀察提示，在DC疫苗治療過(guò)程中，僅少數(shù)患者出現(xiàn)低熱反應(yīng)及輕微的瘤苗注射局部的紅腫、硬結(jié)，沒(méi)有觀察到嚴(yán)重的局部反應(yīng)及血液細(xì)胞學(xué)、肝腎功能方面的明顯變化。說(shuō)明通過(guò)熱休克腫瘤細(xì)胞后負(fù)載DC制備的DC疫苗以及疫苗的治療方式對(duì)于患者是相對(duì)安全的，可以在臨床推廣應(yīng)用?？傊?，我們的研究通過(guò)DC疫苗的免疫學(xué)效應(yīng)證實(shí)，負(fù)載腫瘤細(xì)胞抗原的DC疫苗對(duì)于惡性黑色素瘤根治術(shù)后的輔助治療是安全有效的。但是評(píng)價(jià)DC輔助治療是否有效的最終指標(biāo)是無(wú)病生存期和總生存期，因此我們將繼續(xù)隨訪DC輔助治療對(duì)于生存期的影響，以明確其臨床價(jià)值。

［1］ Redman BG，Chang AE，Whitfield J，et al.Phase Ib trial assessing autologous，tumor-pulsed dendritic cells as a vaccine administered with or without IL-2 in patients with metastatic melanoma［J］.J Immunother，2008，31(6):591-598.

［2］ O'Rourke MG，Johnson MK，Lanagan CM，et al.Dendritic cell immunotherapy for stage IV melanoma［J］.Melanoma Res，2007，17(5):316-322.

［3］ 朱玉蘭，錢(qián)科卿，高海燕，等.熱休克凋亡乳腺癌細(xì)胞負(fù)載的DC體內(nèi)激發(fā)Thl型免疫反應(yīng)［J］.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，28(1):113-116.

［4］ 邵純，宋潔，徐志萍.DC疫苗埋藏式多點(diǎn)皮內(nèi)注射在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用及臨床觀察［J］.護(hù)士進(jìn)修雜志，2008，23(7):649-650.

［5］ Brossart P，Wirths S，Stuhler G，et al.Induction of cytotoxic T-lymphocyte response in vivo after vaccinations with peptide-pulsed dendritic cells［J］〗.Immunibiology，2000，96(9):3102-3108.

［6］ Engell-Noerregaard L，Hansen TH，Andersen MH，et al.Review of clinical studies on dendritic cell-base vaccination of patients with malignant melanoma:assessment of correlation between clinical response and vaccine parameters［J］.Cancer Immunol Immunother，2009，58(1):1-14.

［7］ Shi H，Cao T，Connlly JE，et al.Hyperthermia enhance CTL cross-priming［J］.J Immuno，2006，176(4):2134-2141.

［8］ Hadden JW.Immunodeficiency and cancer:prospects for correction［J］.Int Immunopharmacol，2003，3(8):1061-1071.

［9］ 沈洪彥，孫治君.Th1/Th2細(xì)胞與腫瘤復(fù)發(fā)［J］.中國(guó)普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2006，13(4):490-492.

［10］ López MN，Pereda C，Segal G，et al.Prolonged survival of dendritic cell-vaccinated melanoma patients correlates with tumorspecific delayed type IV hypersensitivity response and reduction of tumor growth factor beta-expressing T cells［J］.J Clin Oncol，2009，27(6):945-952.