干文娟 馮一中 李峰

1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，江蘇 蘇州 215006；2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理學(xué)系，江蘇 蘇州 215123；3.蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科，江蘇 蘇州 215004

缺氧是實(shí)體腫瘤生長過程中普遍存在的一種現(xiàn)象，腫瘤細(xì)胞的侵襲性和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移性與缺氧有關(guān)，介導(dǎo)缺氧反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)者是缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)，HIF-1由HIF-1α和HIF-1β兩個(gè)亞基組成。其中HIF－1a是HIF-1的活性亞基，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展和預(yù)后預(yù)測中具有重要意義，目前對于HIF-1α在胰腺癌中表達(dá)情況的研究國內(nèi)外還鮮見報(bào)道。熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)是生物體中普遍存在的高度保守的蛋白質(zhì)，其主要的生物學(xué)功能是在應(yīng)激狀態(tài)下與靶蛋白形成復(fù)合體，以調(diào)節(jié)靶蛋白的活性和功能，但又不參與靶蛋白的組成。因此，HSP又被稱為“分子伴侶”或“伴侶蛋白”。HSP90是分子伴侶中一組較為獨(dú)特的蛋白質(zhì)，除了作為分子伴侶參與蛋白質(zhì)的折疊、運(yùn)輸和合成過程以外，還能和一系列參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中的激酶分子和突變蛋白質(zhì)相結(jié)合，并調(diào)節(jié)它們的穩(wěn)定性，從而影響多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

HSP90在胰腺癌中的過表達(dá)可能參與了胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移［1］。本研究利用組織芯片技術(shù)結(jié)合免疫組化方法檢測胰腺癌組織中HIF-1α、HSP90蛋白的表達(dá)及其與胰腺癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，探討HIF-1α、HSP90在胰腺癌發(fā)生過程中的作用及對預(yù)后的影響。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

收集本校附屬醫(yī)院及部分外院1993年—2007年胰腺癌手術(shù)標(biāo)本和臨床資料齊備者88例，所有患者均未給予術(shù)前放療、化療，且腫瘤組織均制備組織切片并行HE染色，并由2名病理醫(yī)師采用雙盲法確診為胰腺導(dǎo)管腺癌，其中位于胰頭者64例，胰體尾部者24例；男性59例，女性29例，年齡39～80歲，中位年齡62.50歲；腫瘤直徑≤4 cm者45例，>4 cm者43例；按照1997年國際抗癌協(xié)會(huì)(UICC)制定的TNM臨床分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)：Ⅰ期29例，Ⅱ期11例，Ⅲ期27例，Ⅳ期21例。組織學(xué)分級為：高分化腺癌17例，中分化腺癌50例，低分化腺癌21例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者39例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者49例。88例患者中有53例獲得隨訪資料，隨訪時(shí)間為2個(gè)月～6年，平均隨訪時(shí)間為(13.32±10.35)個(gè)月。其中死亡數(shù)為48例，生存(截尾數(shù)據(jù)) 數(shù)為5例。另外選取11例同時(shí)期非腫瘤性胰腺組織手術(shù)標(biāo)本作為對照。

1.2 方法

1.2.1 組織芯片的制作

標(biāo)本均為4%甲醛溶液固定，常規(guī)組織處理、石蠟包埋。采用手工制作組織芯片，所用組織芯片制作儀為Instrumendics公司產(chǎn)品，取樣針直徑1.5 mm，組織芯間距1.0 mm。組織芯片制作步驟見文獻(xiàn)［2］。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測

對HIF-1α、HSP90分別采用SABC法、EnVision染色法，染色步驟按產(chǎn)品說明書進(jìn)行，DAB顯色，一抗HIF-1α多克隆抗體(BA-0912)及二抗生物素化羊抗兔IgG抗體均購自Santa Cruz公司，HIF-1α抗體的工作濃度為1∶50，羊抗兔IgG抗體為即用型抗體。HSP90α/β(N-17)多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，工作濃度為1∶100，即用型EnVision試劑(HRP/Rabbit)購于丹麥Dako公司。用PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性的胰腺癌切片作為陽性對照。

1.2.3 免疫組織化學(xué)陽性結(jié)果判定

用雙盲法由2位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師分別對免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行評估。鏡檢顯示胞質(zhì)或胞核染為淡黃色至棕黃色為陽性細(xì)胞標(biāo)志。HIF-1α蛋白的陽性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)，少數(shù)定位于細(xì)胞核，HSP90在細(xì)胞的胞質(zhì)及胞核均有表達(dá)，以胞核表達(dá)為主。在高倍鏡(×400)下對每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，共計(jì)1 000個(gè)。參照Gustavo等［3］的方法，綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比進(jìn)行半定量處理；根據(jù)染色強(qiáng)度的評分標(biāo)準(zhǔn)為：沒有染色為0分；弱染色但強(qiáng)于陰性對照為1分；中度染色為2分；強(qiáng)染色為3分；根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)的評分標(biāo)準(zhǔn)為：無陽性細(xì)胞數(shù)為0分；不足34%陽性細(xì)胞數(shù)為1分；34%～66%陽性細(xì)胞數(shù)為2分；>66%陽性細(xì)胞數(shù)為3分。上述評分結(jié)果兩項(xiàng)相乘，0～6分為低表達(dá)，>6分為高表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)軟件使用SPSS 13.0軟件包。HIF-1α、HSP90蛋白在非腫瘤性胰腺組織及胰腺癌各臨床參數(shù)之間表達(dá)差異的比較采用四格表資料的χ2檢驗(yàn)。用Spearman秩相關(guān)進(jìn)行HIF-1α、HSP90蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析。對有隨訪資料的HIF-1α、HSP90的表達(dá)作出Kaplan-Meier生存曲線，各組間生存率用log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行組間生存率的比較，HIF-1α、HSP90的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系采用單因素Cox回歸模型進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 組織芯片

成功制備胰腺癌組織芯片蠟塊1個(gè)，為11×9點(diǎn)組織列陣，含99個(gè)位點(diǎn)，無組織芯脫落(圖1A)。組織芯片切片HE染色顯示所有位點(diǎn)組織結(jié)構(gòu)保存良好，無明顯壞死組織，組織芯片排列整齊(圖1B)。

2.2 HIF-1α與HSP90蛋白表達(dá)

2.2.1 HIF-1α蛋白表達(dá)

胰腺癌組織中HIF-1α蛋白主要定位于癌細(xì)胞胞質(zhì)和胞核，以胞質(zhì)著色為主(圖2A)，非腫瘤性胰腺組織均無HIF-1α表達(dá)。88例胰腺癌中有67例HIF-1α高表達(dá)(76.1%)，而對照組胰腺組織中HIF-1α表達(dá)陰性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.910，P<0.001)。HIF-1α高表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.01，表1)。

圖1 組織芯片圖Fig.1 Tissue microarray

2.2.2 HSP90蛋白表達(dá)

胰腺癌組織中HSP90蛋白主要定位于癌細(xì)胞胞質(zhì)和胞核，以胞核著色為主(圖2B)。本組患者HSP90蛋白在胰腺癌中高表達(dá)率為73.9%，在非腫瘤性胰腺組織中高表達(dá)率為18.2%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.858，P<0.001)。HSP90高表達(dá)與腫瘤TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.01)；而與腫瘤大小、部位、病理分級無關(guān)(P>0.05，表1)。

2.2.3 HIF-1α、HSP90在胰腺癌中表達(dá)的相關(guān)性

Spearman秩相關(guān)分析顯示，在胰腺癌中，HIF-1α與HSP90表達(dá)呈顯著正相關(guān)(P<0.01，表2)。

表1 HIF-1α和HSP90的表達(dá)與胰腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系Tab.1 The relationship between HIF-1α and HSP90 expression and clinical pathological characteristics of pancreatic carcinoma patients[n(%)]

圖2 HIF-1α和HSP90在胰腺癌中陽性表達(dá)Fig.2 Positive expression of HIF-1α and HSP90 in pancreatic carcinoma

表2 胰腺癌中HIF-1α、HSP90的相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis of HIF-1α and HSP90 in the pancreatic carcinoma

2.3 HIF-1α、HSP90表達(dá)與胰腺癌患者生存期的關(guān)系

對53例獲得隨訪結(jié)果的胰腺癌患者進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，結(jié)果顯示HIF-1α低表達(dá)組患者的總生存率明顯高于各自高表達(dá)組，用log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行組間生存率檢驗(yàn)結(jié)果顯示，HIF-1α組間生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.098，P<0.001)，即HIF-1α高表達(dá)與胰腺癌預(yù)后不良有關(guān)，而HSP90的高表達(dá)組與低表達(dá)組在Kaplan-Meier曲線中有相交點(diǎn)，log-rank檢驗(yàn)組間生存率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.068，P=0.08，圖3、4)。

經(jīng)Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析，單因素分析顯示，HIF-1α表達(dá)可作為評估胰腺癌患者預(yù)后的指標(biāo)(表3)。

圖3 HIF-1α表達(dá)與生存期的關(guān)系Fig.3 Relationship of HIF-1α expression and life span

圖4 HSP90表達(dá)與生存期的關(guān)系Fig.4 Relationship of HSP90 expression and life span

表3 胰腺癌單因素生存(COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析)結(jié)果Tab.3 Univariate survival result of pancreatic carcinoma (Cox rate risk model analysis)

3 討 論

缺氧是腫瘤微環(huán)境的基本特征之一，同時(shí)腫瘤細(xì)胞的缺氧也是腫瘤發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化甚至轉(zhuǎn)移的啟動(dòng)因子。HIF-1α是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧代謝的關(guān)鍵因子之一，也是迄今發(fā)現(xiàn)的惟一能在特異性缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性作用的轉(zhuǎn)錄因子。

HIF-1α在胰腺癌中存在高表達(dá)。Kitada等［4］用免疫組織化學(xué)的方法對胰腺癌組織進(jìn)行HIF-1α檢測，結(jié)果是29例(59.2%)呈過表達(dá)，淋巴結(jié)局部轉(zhuǎn)移的有19例(76.0%)呈過表達(dá)，而在非腫瘤的胰腺組織中表達(dá)呈陰性，HIF-1α與胰腺癌的腫瘤大小及TNM分期顯著相關(guān)。Akakura等［5］也證實(shí)20株胰腺癌細(xì)胞有15株表達(dá)HIF-1α蛋白，而且HIF-1α表達(dá)與胰腺癌的擴(kuò)增和生存有關(guān)。本研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道基本一致：88例胰腺癌中67例HIF-1α呈高表達(dá)，而11例正常胰腺組織中無表達(dá)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。HIF-1α高表達(dá)率與胰腺癌的大小相關(guān)(P<0.01)，即表明大多數(shù)胰腺癌組織存在著缺氧，在體積大的腫瘤組織中HIF-1α高表達(dá)率高，考慮是與體積大的腫瘤組織生長過快，內(nèi)部缺氧發(fā)生早，且程度重有關(guān)；研究還表明，HIF-1α高表達(dá)率與胰腺癌的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.01)，表明HIF-1α蛋白的表達(dá)預(yù)示胰腺癌有較高的惡性度和侵襲性。

關(guān)于HIF-1α與胰腺癌預(yù)后的關(guān)系報(bào)道中，Shibaji等［6］研究顯示，HIF-1α表達(dá)與胰腺癌不良預(yù)后呈正相關(guān)，其高表達(dá)的患者預(yù)后較差。Sun等［7］研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α高表達(dá)患者的總生存率低，Cox回歸分析顯示，HIF-1α是胰腺癌的預(yù)后指標(biāo)。本研究隨訪分析結(jié)果顯示，HIF-1α高表達(dá)者預(yù)后較差，HIF-1α高表達(dá)與低表達(dá)生存曲線差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，經(jīng)單因素、多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析顯示，HIF-1α表達(dá)具有獨(dú)立預(yù)后意義(P<0.05)，即HIF-1α高表達(dá)與胰腺癌不良預(yù)后有關(guān)，本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相一致，由此可見，快速生長的胰腺癌細(xì)胞可產(chǎn)生過量的HIF-1α，激活多種靶基因的轉(zhuǎn)錄，提高能量代謝及血管形成體系，使之適應(yīng)這一缺氧環(huán)境而繼續(xù)增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移。因此，HIF-1α的表達(dá)可反映胰腺癌的生物學(xué)行為，可以作為判斷胰腺癌浸潤、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的有價(jià)值指標(biāo)。

至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HSP90在多數(shù)腫瘤中呈高表達(dá)。Ogata等［8］報(bào)道胰腺癌中HSP90a呈選擇性高表達(dá)，且與腫瘤的致癌作用有關(guān)。Kim等［9］研究結(jié)果表明，HSP90抑制劑選擇性阻止了胰腺癌細(xì)胞的生長和擴(kuò)增，可見HSP90與胰腺癌有著密切的聯(lián)系。本研究結(jié)果顯示：HSP90在胰腺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常胰腺組織(P<0.01)，這一結(jié)果與各文獻(xiàn)中報(bào)道的HSP90在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)的結(jié)論一致。HSP90在正常胰腺組織中的表達(dá)，認(rèn)為其作為分子伴侶參與調(diào)節(jié)正常胰腺腺泡細(xì)胞及導(dǎo)管細(xì)胞的生長和增殖；而在胰腺癌中的過表達(dá)，可能與胰腺癌細(xì)胞的惡性增殖相關(guān)，需要大量的HSP90調(diào)節(jié)和穩(wěn)定這一異常增殖過程有關(guān)。

目前對于HSP90與腫瘤病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系報(bào)道不一。Pick等［10］研究認(rèn)為，HSP90與乳腺癌的病理分級、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，是乳腺癌獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。而Kurahashi等［11］對172例前列腺標(biāo)本進(jìn)行免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)HSP90與病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小無關(guān)。本研究結(jié)果顯示：胰腺癌中臨床分期越晚的HSP90表達(dá)越高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組HSP90表達(dá)比無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示HSP90與胰腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移能力有一定的相關(guān)性。本研究結(jié)果還顯示：HSP90與胰腺癌的病理分級無關(guān)，可能與HSP90表達(dá)存在著組織差異性有關(guān)；HSP90的表達(dá)與胰腺癌患者預(yù)后無關(guān)，可能與HSP90作為分子伴侶的功能有關(guān)，其機(jī)制有待進(jìn)一步論證。

有關(guān)HIF-1α和HSP90的關(guān)系報(bào)道不多，Minet等［12］研究認(rèn)為在缺氧條件下，HSP90與HIF-1α的bHLH-PAS 結(jié)構(gòu)域結(jié)合來激活HIF-1α，而且HSP90的活性對于HIF-1α的激活作用是必須的。Lang等［13］研究結(jié)果表明，HSP90抑制劑17-AAG阻止了胰腺癌IL-6/STAT3/HIF-1α自分泌環(huán)，抑制了腫瘤的生長。Jennifer等［14］使用VHL功能缺失的腎癌細(xì)胞株RCC進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了HSP90抑制劑的功能：⑴通過氧非依賴E3泛素連接酶促進(jìn)了HIF-1α降解。⑵減少了HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性。由此可以推斷，HSP90與HIF-1α的降解和轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，HIF-1α和HSP90聯(lián)合表達(dá)與胰腺癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。

隨著研究的不斷深入，目前已將HIF-1α、HSP90作為治療各類腫瘤的靶點(diǎn)，如HIF-1α516、格爾德霉素(geldanamycin，GA)等已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，本研究結(jié)果為研發(fā)藥物來干預(yù)和治療胰腺癌提供了理論依據(jù)。

［1］ 劉峰, 干文娟, 馮一中. HSP90在胰腺癌組織芯片中的表達(dá)及臨床意義［J］. 中國血液流變學(xué)雜志, 2009, 19(1): 125-127.

［2］ 朱明華.組織微陣列及其在腫瘤病理研究中的應(yīng)用［J］.中華病理學(xué)雜志, 2002, 31: 72-74.

［3］ GUSTAVO A, TIMOTHY T, GUANG Y, et al. High levels of phosphorylated form of Akt-1 in prostate cancer and nonneoplastic prostate tissues are strong predictors of biochemical recurrence［J］. Clin Cancer Res, 2004, 10: 6572-6578.

［4］ KITADA T, SEKI S, SAKAGUCHI H, et al.Clinicopathological significance of hypoxia-inducible factor-1alpha expression in human pancreatic carcinoma［J］.Histopathology, 2003, 43(6): 550-555.

［5］ AKAKURA N, KOBAVASHI M, HORIUCHI I, et al.Constitutive expression of hypoxia-inducible factor-1 alpha renders pancreatic cancer cells resistant to apoptosis induced by hypoxia and nutrient deprivation［J］. Cancer Res, 2001,61(17): 6548-6554.

［6］ SHIBAJI T, NAGAO M, IKEDA N, et al. Prognostic significance of HIF-1 alpha overexpression in human pancreatic［J］. Anticancer Res, 2003, 23(6C): 4721-4727.

［7］ SUN H C, QIU Z J, LIU J, et al. Expression of hypoxiainducible factor-1 alpha and associated proteins in pancreatic ductal adenocarcinoma and their impact on prognosis［J］.Int J Oncol, 2007, 30(6): 1359-1367.

［8］ OGATA M, NAITO Z, TANAKA S, et al. Overexpression and localization of heat shock proteins mRNA in pancreatic carcinoma［J］. J Nippon Med Sch, 2000, 67(3): 177-185.

［9］ KIM H L, CASSONE M, JR L O, et al. HIF-1α and STAT3 client proteins interacting with the cancer chaperone Hsp90［J］. Cancer Biol Ther, 2008, 7(1): 1-5.

［10］ PICK E, KLUGER Y, GILTNANE J M, et al. High HSP90 expression is associated with decreased survival in breast cancer［J］. Cancer Res, 2007, 67(7): 2932-2937.

［11］ KURAHASHI T, MIYAKE H, HARA I, et al. Expression of major heat shock proteins in prostate cancer: correlation with clinicopathological outcomes in patients undergoing radical prostatectomy［J］. J Urol, 2007, 177(2): 757-761.

［12］ MINET E, MOTTET D, MICHEL G, et al. Hypoxia-induced activation of HIF-1: role of HIF-1αlpha-Hsp90 interaction［J］. FEBS Lett, 1999, 460(2): 251-256.

［13］ LANG S A, MOSER C, GAUMANN A, et al. Targeting heat shock protein 90 in pancreatic cancer impairs insulin-like growth factor-I receptor signaling, disrupts an interleukin-6/signal-transducer and activator of transcription 3/hypoxiainducible factor-1alpha autocrine loop, and reduces orthotopic tumor growth［J］. Clin Cancer Res, 2007, 13(21): 6459-6468.

［14］ JENNIFER S I, YUN-JIN J, EDWARD G M, et al. Hsp90 Regulations a von hippel lindau-independent hypoxiainducible factor-1-degradative pathway［J］. J Biol Chem,2002, 277(33): 29936-29944.