鄭世珍 李福祥 錢桂生 戢福云

線粒體是真核生物細(xì)胞內(nèi)的重要細(xì)胞器，處于新陳代謝和生物能量轉(zhuǎn)換中心地位，在生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用［1-2］。線粒體通過氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)產(chǎn)生人體用于工作的ATP和維持體溫的熱量，而線粒體偶聯(lián)狀態(tài)則決定著產(chǎn)生ATP和熱量的相對水平。線粒體緊密偶聯(lián)，則ATP能量產(chǎn)生較多;線粒體解偶聯(lián)，則熱量產(chǎn)生較多。伴隨著氧化磷酸化，線粒體產(chǎn)生大量細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)，同時(shí)，線粒體通過開放線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，mtPTP)，調(diào)節(jié)以能量輸出及活性氧損傷為基礎(chǔ)的細(xì)胞凋亡［3］。線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)是細(xì)胞內(nèi)除細(xì)胞核 DNA(nuclear DNA，nDNA)外唯一存在的遺傳物質(zhì)。已有研究顯示，mtDNA突變不僅與人類leber氏遺傳性視神經(jīng)病、線粒體腦肌病、糖尿病、高血壓、心力衰竭、心肌梗塞、視力障礙、神經(jīng)性耳聾、智力衰退、心理障礙、腎功能不全、腫瘤、肌無力等多種疾病的發(fā)生有關(guān)，也在人類適應(yīng)不同氣候環(huán)境時(shí)發(fā)揮著重要作用［3-11］。

一、人類mtDNA

人類mtDNA是除核DNA(nuclear DNA，nDNA)外唯一存在于細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)，屬母系遺傳。人類mtDNA分子由16，569個(gè)堿基組成，呈雙鏈超螺旋閉合環(huán)狀分子，共含有37個(gè)編碼基因，分別編碼16S rRNA和12S rRNA、22個(gè)tRNA和呼吸鏈中13個(gè)多肽(即細(xì)胞色素b、細(xì)胞色素C氧化酶的3個(gè)亞基、ATP酶的2個(gè)亞基以及NADH脫氫酶的7個(gè)亞基)。其中，mtDNA所編碼的13個(gè)多肽是電子傳遞鏈(electron transport chain，ETC)的重要組成成分。線粒體呼吸鏈將來源于NADH和H+的電子轉(zhuǎn)移到復(fù)合物Ⅰ(NADA脫氫酶)或?qū)㈢晁猁}的電子傳遞給復(fù)合物Ⅱ(琥珀酸脫氫酶)，再依次傳遞給輔酶Q、復(fù)合物Ⅲ、細(xì)胞色素C和復(fù)合物Ⅳ(細(xì)胞色素c氧化酶)，最后傳遞給1/2個(gè)O2生成H2O。與此同時(shí)，導(dǎo)致跨膜質(zhì)子移位形成跨膜質(zhì)子梯度和/或跨膜電位。線粒體內(nèi)膜上的ATP合成酶利用跨膜質(zhì)子梯度能量合成ATP。合成的ATP通過線粒體內(nèi)膜ADP/ATP載體與細(xì)胞質(zhì)中ADP交換進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，參與細(xì)胞的各種需能過程［12-14］。

內(nèi)源性活性氧(ROS)是線粒體氧化磷酸化的副產(chǎn)品，其產(chǎn)生途徑為:從復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ直接轉(zhuǎn)移一個(gè)電子給O2形成超氧負(fù)離子(superoxide anion，);兩個(gè) 由錳超氧化物歧化酶歧化形成過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2);H2O2失去一個(gè)電子而形成羥基(-OH)。

線粒體活性氧會(huì)損傷線粒體脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，并誘發(fā)mtDNA發(fā)生突變。線粒體也可以通過線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mtPTP)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。當(dāng)出現(xiàn)過度的Ca++吸收、氧化應(yīng)激增強(qiáng)或線粒體ΔΨ、ADP、ATP減少時(shí)，PTP開放并隨之發(fā)生ΔP崩潰，凋亡前體蛋白(細(xì)胞色素c、caspase-9前體、凋亡誘導(dǎo)因子和核酸內(nèi)切酶G)從線粒體內(nèi)膜釋放到胞質(zhì)中，從而降解細(xì)胞蛋白和核酸［14］。

二、人類mtDNA遺傳變異

mtDNA序列突變率很高，其突變率是nDNA上線粒體基因10倍以上［2-13，15-16］。與nDNA相比，mtDNA在結(jié)構(gòu)和功能上有著自己獨(dú)特的特點(diǎn):①mtDNA缺乏組蛋白和DNA結(jié)合蛋白的保護(hù)，并且，mtDNA與氧化磷酸化場所(線粒體內(nèi)膜)相距很近，直接暴露于氧化磷酸化過程中產(chǎn)生的活性氧中，易受到自由基的攻擊;②mtDNA復(fù)制速度很快且催化復(fù)制的DNA聚合酶C不具有校讀功能，復(fù)制錯(cuò)誤率高，與nDNA相比其修復(fù)機(jī)制不完善;③每個(gè)細(xì)胞中含有數(shù)百個(gè)線粒體，每個(gè)線粒體又含多個(gè)DNA分子，因此，細(xì)胞中可同時(shí)存在正常mtDNA和突變mtDNA，即mtDNA具有異質(zhì)性;④mtDNA無內(nèi)含子，mtDNA的突變很容易影響到其基因組內(nèi)的一些重要功能區(qū)域;⑤突變mtDNA是否在組織產(chǎn)生表型效應(yīng)主要決定于突變mtDNA與正常mtDNA相對比例及該組織的能量消耗程度;⑥線粒體是半自主性細(xì)胞器，mtDNA基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯受到nDNA的調(diào)控。

mtDNA遺傳變異可以歸納為中性、有害性和適應(yīng)性遺傳變異三種類型。①中性變異包括同義堿基替換(synonymous base substitutions，S)和堿基更換(base changes)，后者所編碼的氨基酸發(fā)生改變或rRNAs、tRNAs序列有所變化，但其功能并未發(fā)生改變。這些變異的種內(nèi)保守指數(shù)(interspecific conservation index，CI)通常較低;②有害變異則是指多肽氨基酸發(fā)生了非同義突變(non-synonymous mutation，NS)或rRNAs、tRNAs序列發(fā)生變化，并顯著地減低了其功能。這些突變可經(jīng)過純化選擇加以消除或?qū)е录膊‘a(chǎn)生;③適應(yīng)性變異則是指多肽氨基酸發(fā)生改變或rRNAs、tRNAs序列發(fā)生變異，這些變異可以改變線粒體進(jìn)化上保守的功能，并且不能通過純化選擇加以消除。反之，該突變可被擴(kuò)充為線粒體在適應(yīng)新環(huán)境時(shí)所形成的mtDNA進(jìn)化樹上一個(gè)區(qū)域特異性的旁枝［13］。已有的研究成果表明，人類祖先從熱帶和亞熱帶非洲移居至較寒冷的歐洲和西伯利亞時(shí)，大約1/4古老的mtDNA遺傳變異有助于人類適應(yīng)新的環(huán)境。

三、人類mtDNA及其環(huán)境適應(yīng)性遺傳變異

適應(yīng)性mtDNA遺傳變異是在對全球原居民mtDNA序列的研究中首次被發(fā)現(xiàn)的。由于mtDNA具有母系遺傳的特性，mtDNA遺傳變異不能通過重組消除而只能不斷沿著呈放射狀的母性譜系累積，所以，不同個(gè)體之間mtDNA核苷酸數(shù)量上的差別與他們從同一個(gè)女性祖先分枝的時(shí)間是相對應(yīng)的。

對全球mtDNA序列變異的研究表明，所有的mtDNA變異可以歸納為一個(gè)單一模式的mtDNA序列，即單倍型。單倍型序列在公元前150 000年至200 000年的非洲就已經(jīng)存在［1-2］。以此為起源，4個(gè)特異的亞撒哈拉非洲mtDNA單倍型(L0、L1、L2和L3)呈輻射狀形成新的相關(guān)的單倍型。公元前65 000年，非洲東北部的L3單倍型群體離開非洲而移居至溫帶的歐亞大陸，從而形成M和N單倍型。而由于亞洲單倍型mtDNA的增多，在西伯利亞的東北部，現(xiàn)僅存3個(gè)富集的單倍型A、C和D。公元前20 000年出現(xiàn)白令大陸橋時(shí)，單倍型A、C和D橫跨白令海峽來到北美洲。大約公元前15 000年，單倍型X也穿過北極圈，可能經(jīng)由歐洲扎根在北美的北部中心。隨后，單倍型B在公元前12 000年到15 000年可能通過航海而繞過北極在北美洲的北部、中部及南部與單倍型A、C、D 會(huì)合［1-2，14］。

在分析mtDNA單倍型這一過程中，研究者發(fā)現(xiàn)，mtDNA分布存在兩個(gè)明顯的中斷，第一個(gè)中斷出現(xiàn)在大量的非洲群體移居至溫帶歐亞大陸后所形成的兩個(gè)譜系M和N之間，第二個(gè)中斷則出現(xiàn)在當(dāng)前大量的歐亞群體移居至北極寒冷地區(qū)后所剩下的四個(gè)單倍型A、C、D和X之間。由于這兩個(gè)明顯的中斷都與氣候的顯著變化相關(guān)，因此，可以猜測，某種特定的mtDNA遺傳變異能降低線粒體耦聯(lián)效率，從而增加產(chǎn)熱量以幫助人類移居并適應(yīng)更為寒冷的北方高緯度地區(qū)［1-2］。對西伯利亞雅庫特人和溫帶地區(qū)人群基礎(chǔ)代謝率的觀察結(jié)果支持了這個(gè)猜想，前者的基礎(chǔ)代謝率明顯高于后者［17］。

計(jì)算氨基酸替換突變率(NS/S)則進(jìn)一步證實(shí)了適應(yīng)性mtDNA變異的存在。通過分析各個(gè)不同地區(qū)mtDNA多肽基因的NS/S比例發(fā)現(xiàn)(包括熱帶、亞熱帶非洲群體的單倍型L0、L1、L2和L3，溫帶歐洲群體單倍型 H、I、J、T、U、UK、V 和 W，北極歐亞單倍型 A、C、D 和 X)，ATP6基因在北極居民、cyt b基因在歐洲居民及COI基因在非洲居民中均發(fā)現(xiàn)有錯(cuò)義突變，nDNA基因的突變則表現(xiàn)出與地理區(qū)域相關(guān)性［2，18］。研究者繼續(xù)對mtDNA遺傳變異的地理區(qū)域性分布進(jìn)行了更深入的研究。對從現(xiàn)有的2565個(gè)mtDNA序列演繹出的mtDNA進(jìn)化圖進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，從熱帶非洲單倍型L的100%到歐亞大陸M+N單倍型的140%，到寒帶N單倍型的180%，進(jìn)化樹內(nèi)部分枝的錯(cuò)義突變發(fā)生頻率是逐漸增多的。而且，熱帶非洲群體的內(nèi)部分枝上氨基酸變化的種內(nèi)CI(氨基酸功能發(fā)生改變的重要性標(biāo)志)也較北極群體有所增加。實(shí)際上，26．3%的古老內(nèi)部分枝上的氨基酸置換的CI與22個(gè)已知的致病的mtDNA錯(cuò)義突變的平均值相差不超過兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差(www．mitomap．org)，大約1/4的古老的錯(cuò)義突變具有重要的功能并在適應(yīng)性選擇中得到富集［1］。

許多最有意義的適應(yīng)性錯(cuò)義突變都發(fā)生在mtDNA進(jìn)化樹分枝堿基上，從而呈輻射狀形成一個(gè)新的地理區(qū)域性分枝［1］。比如，發(fā)生在單倍型N中的兩個(gè)錯(cuò)義突變ATP6(A59T)和ND3(A114T)就是促使單倍型N從非洲群體L3系中分離出來的。這些突變改變了高度保守的氨基酸，可能使非洲群體得以移居歐亞大陸。對于和北極單倍型A、C、D和X相關(guān)的適應(yīng)性突變則可通過其CI以及突變距離單倍型根部的位置來鑒定。例如，研究發(fā)現(xiàn)，在單倍型A有兩個(gè)非常保守、位于根部的氨基酸突變:一個(gè)是mtDNA蛋白ND2上的核苷酸突變(4824G)，導(dǎo)致產(chǎn)生錯(cuò)義突變T119A(CI=82．1%);另一個(gè)是ATP6上的核苷酸突變(8794T)，導(dǎo)致產(chǎn)生錯(cuò)義突變H90Y(CI=72%)。西伯利亞亞單倍型C2也含有兩個(gè)保守的位于根部的變異:ND4上堿基發(fā)生突變(11969A)，產(chǎn)生錯(cuò)義突變A404T(CI=85%);cyt b上堿基發(fā)生突變(15204C)，產(chǎn)生錯(cuò)義突變I153T(CI=85%)。同樣，從單倍型N衍出歐洲單倍型T和J。在單倍型T中發(fā)現(xiàn)ND2基因在4917(G＞A)發(fā)生突變，導(dǎo)致氨基酸發(fā)生變化(D150N，CI=90%)。單倍型J又分為兩個(gè)亞單倍型J1和J2，各自以靠近進(jìn)化樹根部的cyt b基因的一個(gè)堿基置換突變命名。單倍型J2是15257位堿基發(fā)生突變(15257A)，導(dǎo)致氨基酸發(fā)生改變(D171N，CI=95%)，而J1則是14798位堿基發(fā)生突變(14798C)，導(dǎo)致氨基酸發(fā)生改變(F18L，CI=77%)。在亞單倍型UK、北極單倍型A、C、D和X中也發(fā)現(xiàn)了14798C突變。這些研究表明，mtDNA的進(jìn)化具有趨同性，從而進(jìn)一步證實(shí)線粒體高度保守序列的錯(cuò)義突變在人類對環(huán)境適應(yīng)性方面具有重要的意義。

線粒體作為能量供應(yīng)細(xì)胞器，參與人類重要的生命活動(dòng)。同時(shí)，作為除nDNA外唯一存在的遺傳物質(zhì)，其DNA突變在人類多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，以及人類適應(yīng)生存環(huán)境中發(fā)揮著重要作用。深入了解和研究線粒體及其DNA將會(huì)為進(jìn)化學(xué)、遺傳學(xué)、病原學(xué)、病理生理學(xué)，以及疾病的治療帶來新的視野和途徑。

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