平曉春 李幼生

隨著細(xì)胞分選和基因標(biāo)記技術(shù)逐漸成熟，干細(xì)胞研究由原來(lái)的干細(xì)胞移植雛形—骨髓移植研究逐步發(fā)展成為一個(gè)新興的學(xué)科。作為機(jī)體內(nèi)細(xì)胞更新最快的組織器官之一——小腸，其干細(xì)胞的研究日益受到人們的關(guān)注。由于小腸黏膜單層上皮細(xì)胞的簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)和特有的晝夜更新節(jié)律，小腸干細(xì)胞成為繼造血干細(xì)胞和皮膚干細(xì)胞之后新的研究熱點(diǎn)。同時(shí)，由于部分腸道疾病導(dǎo)致的黏膜破壞，腸功能難以自我代償，小腸干細(xì)胞移植為腸黏膜的再生和腸功能的恢復(fù)提供了新的前景。本文將結(jié)合干細(xì)胞的諸多屬性和近年來(lái)對(duì)小腸干細(xì)胞研究的進(jìn)展，對(duì)小腸干細(xì)胞的位置、更新節(jié)律、標(biāo)記物和信號(hào)傳導(dǎo)等做一簡(jiǎn)要綜述。

一、小腸黏膜的細(xì)胞組份和晝夜更新節(jié)律

小腸是一個(gè)管狀的器官，從外到內(nèi)有漿膜層、肌層和黏膜層。承擔(dān)小腸主要的消化吸收功能的是位于黏膜層的上皮細(xì)胞，這些細(xì)胞肩負(fù)著消化食物、吸收營(yíng)養(yǎng)以及抵御腸道微生物入侵的任務(wù)。因此，小腸黏膜在巨大的工作負(fù)荷下，每2～7 d需要更新1次來(lái)替換損傷和衰老的黏膜。給予小腸黏膜更新動(dòng)力的則是小腸黏膜的隱窩。小腸黏膜通過(guò)形成褶皺來(lái)增加吸收面積，也由此產(chǎn)生了小腸黏膜特有的絨毛-隱窩結(jié)構(gòu)。小腸黏膜突向小腸腔內(nèi)的結(jié)構(gòu)稱為絨毛，凹陷入腸壁內(nèi)的結(jié)構(gòu)稱為隱窩。從“山谷”的隱窩到“山頂”的絨毛，整齊地排列著以柱狀上皮細(xì)胞為主的單層細(xì)胞群，這種細(xì)胞群構(gòu)成了黏膜的基本單位——“絨毛-隱窩”軸。每個(gè)絨毛由6個(gè)絨毛-隱窩軸組成。細(xì)胞在這一軸上相應(yīng)的位置代表著這個(gè)細(xì)胞的分化年齡。新分裂的細(xì)胞永遠(yuǎn)是從隱窩源源不斷地涌出，推動(dòng)整個(gè)軸向絨毛上方移動(dòng)。衰老的細(xì)胞將在絨毛頂端凋亡、脫落。隱窩和絨毛的交界地方是分裂細(xì)胞和不分裂細(xì)胞的分界線。當(dāng)細(xì)胞出了這條分界線，代表了這個(gè)細(xì)胞已完成它生命周期中的所有分裂活動(dòng)，它將獲得某種成熟細(xì)胞的特性，并在絨毛的某個(gè)位置上執(zhí)行它的功能。處于交界線以下、占據(jù)隱窩上2/3的是一群在形態(tài)上不同于成熟細(xì)胞的未分化細(xì)胞，它們被稱為短暫增殖細(xì)胞(transit-amplifying cells)。它們每12～16 h分裂1次，經(jīng)過(guò)約6次細(xì)胞分裂，就離開(kāi)隱窩向絨毛方向移行，逐步分化成各種成熟的上皮細(xì)胞，如腸絨毛細(xì)胞、杯狀細(xì)胞或腸內(nèi)分泌細(xì)胞[1]。而占據(jù)隱窩下1/3的是位于最底部的Paneth細(xì)胞和可能存在的小腸干細(xì)胞。

二、如何尋找小腸干細(xì)胞

干細(xì)胞有兩個(gè)最基本的性質(zhì)：“長(zhǎng)壽”(longevity)和“多向分化潛能”(multipotency)。“長(zhǎng)壽”指的是干細(xì)胞的壽命應(yīng)該與個(gè)體的壽命相當(dāng)，這里并不是說(shuō)單個(gè)細(xì)胞的壽命，而是說(shuō)，某種干細(xì)胞群的數(shù)量和分裂增殖的能力應(yīng)該在機(jī)體的一生中保持在穩(wěn)定的水平。“多項(xiàng)分化潛能”是指干細(xì)胞能夠分裂產(chǎn)生所屬器官的各種成熟分化細(xì)胞。小腸干細(xì)胞同樣應(yīng)具有上述的兩點(diǎn)特征，即這種細(xì)胞在小腸黏膜上的數(shù)量是穩(wěn)定的，同時(shí)這種細(xì)胞產(chǎn)生的子代細(xì)胞能夠形成小腸上的各種成熟細(xì)胞。證明某種細(xì)胞是干細(xì)胞的方法有兩種：一種是干細(xì)胞移植的方法，另一種是基因標(biāo)記的方法。干細(xì)胞移植是干細(xì)胞研究領(lǐng)域內(nèi)的一種經(jīng)典方法，通過(guò)使用某種或某幾種標(biāo)記物將干細(xì)胞從體內(nèi)分選出來(lái)，繼而進(jìn)行體外培養(yǎng)或植入受體進(jìn)行增殖。如果植入或體外培養(yǎng)的細(xì)胞能夠產(chǎn)生其所屬器官的各種成熟的分化細(xì)胞，那這種細(xì)胞就是干細(xì)胞。移植的方法在血液干細(xì)胞的研究中應(yīng)用極為廣泛。臨床上使用的骨髓移植，本質(zhì)上就是造血干細(xì)胞的移植。而基因標(biāo)記的方法則是用特殊的標(biāo)記物在組織上做原位標(biāo)記，觀察所標(biāo)記的細(xì)胞是否能夠產(chǎn)生各種成熟的分化細(xì)胞。這種方法常常需要制作轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物。將一些可調(diào)控的報(bào)告基因插入到干細(xì)胞所特有的基因序列中，利用干細(xì)胞的基因來(lái)啟動(dòng)這些報(bào)告基因的表達(dá)。這種方法實(shí)際上是讓干細(xì)胞及其子代細(xì)胞能夠在一定的誘導(dǎo)條件下表達(dá)報(bào)告基因，從而能夠進(jìn)行干細(xì)胞克隆群的體內(nèi)示蹤。但這種方法的前提是需要知道什么基因是干細(xì)胞特有的。

三、關(guān)于小腸干細(xì)胞位置的兩種假說(shuō)

（一）＋4 位干細(xì)胞說(shuō)

在小腸干細(xì)胞的概念出現(xiàn)以前，人們僅僅知道小腸隱窩是細(xì)胞增殖的源頭。在隱窩里，除了最底部的是分化成熟的Paneth細(xì)胞，其他細(xì)胞都被認(rèn)為是些快速擴(kuò)增的細(xì)胞。至于是否存著單個(gè)的干細(xì)胞或干細(xì)胞在隱窩的什么位置并不十分清楚。一直到20世紀(jì)50年代，“＋4位”小腸干細(xì)胞假說(shuō)開(kāi)始形成，這種假說(shuō)認(rèn)為，如果隱窩是細(xì)胞增殖的源頭，并且細(xì)胞增殖的方向是由下往上的話，那除了最底部的潘式細(xì)胞，位于潘式細(xì)胞之上的且與潘式細(xì)胞直接相鄰的就應(yīng)該是小腸干細(xì)胞。即在隱窩的底部從下往上數(shù)，如果前3個(gè)都是潘式細(xì)胞，第4個(gè)細(xì)胞應(yīng)該是小腸干細(xì)胞。這一假說(shuō)的直接證據(jù)是著名的脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)標(biāo)記物滯留實(shí)驗(yàn)。30年前，Cairns曾提出過(guò)“永生DNA鏈”假說(shuō)。他認(rèn)為，干細(xì)胞在一生中需要反復(fù)分裂擴(kuò)增來(lái)產(chǎn)生足夠的子代細(xì)胞來(lái)維持其所在器官的基本功能；為了保證干細(xì)胞的基因不會(huì)因?yàn)榉磸?fù)復(fù)制而產(chǎn)生錯(cuò)配，干細(xì)胞會(huì)選擇性地保留其模板脫氧核糖核酸DNA 鏈，而將新合成的DNA鏈傳給子代細(xì)胞。即1個(gè)干細(xì)胞進(jìn)行1次分裂后產(chǎn)生的2個(gè)子代細(xì)胞中，其中1個(gè)細(xì)胞會(huì)保留原有細(xì)胞的模板DNA，這個(gè)子代細(xì)胞將代替原來(lái)的干細(xì)胞，保持原有的“靜止?fàn)顟B(tài)”，而另1個(gè)子代細(xì)胞將成為快速增殖細(xì)胞，繼續(xù)分裂繁殖。假如能夠在干細(xì)胞分裂的時(shí)候，給復(fù)制中的DNA一種放射性標(biāo)記物，那2條新合成的子鏈就會(huì)帶上這個(gè)標(biāo)記物，而各自被分配到2個(gè)子代細(xì)胞中。當(dāng)這2個(gè)子代細(xì)胞，1個(gè)成為干細(xì)胞、1個(gè)成為快速增殖細(xì)胞后，后者細(xì)胞內(nèi)的DNA放射標(biāo)記物濃度將會(huì)在以后的反復(fù)細(xì)胞分裂中被沖淡，而前者將維持原有的濃度。這種能夠使放射標(biāo)記物長(zhǎng)期滯留在細(xì)胞內(nèi)的現(xiàn)象一度被認(rèn)為是干細(xì)胞特有的現(xiàn)象。Potten等[2]通過(guò)給發(fā)育中的動(dòng)物脈沖標(biāo)記3HTdR，發(fā)現(xiàn)在小腸隱窩底部向上數(shù)的第4個(gè)細(xì)胞對(duì)放射物滯留最明顯。因此，他認(rèn)為這第4位的細(xì)胞就是小腸的干細(xì)胞。后來(lái)，他又使用放射線損傷的方法，發(fā)現(xiàn)在這個(gè)位置的細(xì)胞對(duì)放射線最敏感，認(rèn)為這些“干細(xì)胞”可能是為了不讓放射線導(dǎo)致的基因損傷混入干細(xì)胞的水平，進(jìn)而提高發(fā)生腫瘤的可能性，而寧可“自我犧牲”來(lái)保證干細(xì)胞水平的基因穩(wěn)定性[3]。遺憾的是，他并沒(méi)有辦法證明小腸上各種成熟的細(xì)胞是由“＋4位”細(xì)胞直接產(chǎn)生的，即前面提到的“多項(xiàng)分化潛能”并不能通過(guò)這種方法證實(shí)。同時(shí)，“永生DNA鏈”一直是學(xué)術(shù)界爭(zhēng)論的焦點(diǎn)之一。因?yàn)檫@一假說(shuō)的前提是“干細(xì)胞的非對(duì)稱分裂”現(xiàn)象，即干細(xì)胞分裂時(shí)必定產(chǎn)生1個(gè)干細(xì)胞，1個(gè)非干細(xì)胞。而實(shí)際情況是，干細(xì)胞分裂時(shí)，能夠產(chǎn)生1個(gè)干細(xì)胞、1個(gè)非干細(xì)胞，也能夠產(chǎn)生兩個(gè)干細(xì)胞，更可能產(chǎn)生2個(gè)非干細(xì)胞。雖然最后一種情況將會(huì)使這個(gè)干細(xì)胞永遠(yuǎn)消失，但機(jī)體內(nèi)某種干細(xì)胞的數(shù)量穩(wěn)定性并不是取決于單個(gè)細(xì)胞，而是取決于這種干細(xì)胞的整體穩(wěn)定性。對(duì)于單個(gè)干細(xì)胞來(lái)說(shuō)，“非對(duì)稱分裂”并不是在每次分裂時(shí)都發(fā)生的。實(shí)際上，在血液干細(xì)胞的分裂過(guò)程中，母鏈DNA并沒(méi)有被選擇性保留在干細(xì)胞內(nèi)[4]。

（二）干細(xì)胞區(qū)域說(shuō)

如果說(shuō)Potten的實(shí)驗(yàn)出發(fā)點(diǎn)是基于干細(xì)胞“長(zhǎng)壽”的特性，那Bjerknes和Cheng的出發(fā)點(diǎn)則是證明干細(xì)胞的“多向分化潛能”。早在30年前，他們就發(fā)現(xiàn)在小腸隱窩最底部，在體型巨大的潘氏細(xì)胞之間，存在著一種狹長(zhǎng)形的柱狀細(xì)胞(CBC)。這種細(xì)胞有不同與其他任何小腸成熟細(xì)胞的未分化特征[5]。后來(lái)的Dlb-1克隆標(biāo)記實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這種細(xì)胞的多項(xiàng)分化潛能。Dlb-1是一個(gè)基因位點(diǎn)，它編碼一種凝集素的結(jié)合位點(diǎn)。帶有這種基因的小鼠，其小腸能特異性地結(jié)合Dolichus bi florus凝集素，從而使小腸顯色。使用變異原亞硝基乙脲(NEU)能使Dlb-1-/-位點(diǎn)變異成Dlb-1+/+。Bjerknes和Cheng在對(duì)Dlb-1-/-的SWR小鼠使用NEU后，發(fā)現(xiàn)在凝集素結(jié)合陰性背景的小腸上出現(xiàn)了部分以隱窩為單位的凝集素陽(yáng)性細(xì)胞群。這些細(xì)胞遍布所在的隱窩－絨毛軸。陽(yáng)性細(xì)胞包含有小腸的各種成熟細(xì)胞[6]。如果Dlb-1的變異發(fā)生在小腸干細(xì)胞水平，那變異后的干細(xì)胞及其子代細(xì)胞都應(yīng)該獲得凝集素結(jié)合的特性。在應(yīng)用變異原后的不同時(shí)間點(diǎn)觀察小腸，發(fā)現(xiàn)最初產(chǎn)生的凝集素陽(yáng)性細(xì)胞—“Mix”細(xì)胞首先出現(xiàn)在+4位，然后色素帶向絨毛上移行形成了腸絨毛細(xì)胞和杯狀細(xì)胞，向下移行成為潘氏細(xì)胞。“Mix”細(xì)胞因此被認(rèn)為是小腸成熟細(xì)胞的共同起源，而這種細(xì)胞被認(rèn)為是由CBC直接后代。這個(gè)實(shí)驗(yàn)首次證明了小腸干細(xì)胞的“多向分化潛能”，也形成了小腸干細(xì)胞區(qū)域假說(shuō)。這種假說(shuō)認(rèn)為，小腸干細(xì)胞極有可能是存在于位于隱窩底部、潘式細(xì)胞之間的狹長(zhǎng)柱狀細(xì)胞。

四、小腸干細(xì)胞的特異性標(biāo)記物的出現(xiàn)

對(duì)小腸干細(xì)胞具體位置的認(rèn)識(shí)，為小腸干細(xì)胞特異性標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)提供了有利的線索。各種依據(jù)細(xì)胞位置的干細(xì)胞標(biāo)記物依次被提出。Musashi-1、磷酸化PTEN和磷酸化AKT、sFRP5、Sox4、Dcamkl1都曾被認(rèn)為是小腸干細(xì)胞的特異標(biāo)記物[7-10]，但上述分子并不僅只限在未分化的細(xì)胞表達(dá)，部分成熟細(xì)胞也表達(dá)這些標(biāo)記物。同時(shí)，上述發(fā)現(xiàn)也沒(méi)能證明帶有這些標(biāo)記物的細(xì)胞具有“多項(xiàng)分化潛能”。隨著對(duì)干細(xì)胞性質(zhì)了解的進(jìn)一步深入，Wnt信號(hào)通路被發(fā)現(xiàn)是小腸細(xì)胞繁殖的主要推動(dòng)信號(hào)。通過(guò)一個(gè)巧妙的體內(nèi)示蹤實(shí)驗(yàn)，Barker等[11]發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路中的受體之一的Lgr5/Gpr49就是小腸干細(xì)胞的特異性標(biāo)記物。他們將一個(gè)報(bào)告基因序列EGFP-IRES-CreERT2插入到Lgr5基因啟動(dòng)子的后面，使熒光蛋白GFP只能在Lgr5的控制下表達(dá)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小腸上帶有熒光的細(xì)胞就是之前發(fā)現(xiàn)的CBC。他們又將這種轉(zhuǎn)基因小鼠和Rosa26R-LacZ小鼠雜交，產(chǎn)生的子代小鼠再用雌激素Tamoxifen來(lái)激活其體內(nèi)Lgr5基因控制下所插入序列中的Cre重組酶。位于LacZ前面的終止子序列在Cre重組酶的作用下被切除，LacZ由此得以表達(dá)。在子代小鼠給藥1d后，在小腸隱窩的最底部、潘式細(xì)胞之間出現(xiàn)了LacZ陽(yáng)性的藍(lán)色細(xì)胞。在給藥5 d后，這些藍(lán)色細(xì)胞延續(xù)到了絨毛頂端，它們中包括腸絨毛細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞和潘氏細(xì)胞在內(nèi)的所有成熟上皮細(xì)胞。這一現(xiàn)象說(shuō)明了一個(gè)Lgr5陽(yáng)性的細(xì)胞能夠產(chǎn)生所有的小腸上皮成熟細(xì)胞。Lgr5是小腸干細(xì)胞的特異性標(biāo)記物。同時(shí)，他們也發(fā)現(xiàn)小腸干細(xì)胞不是想象的那樣保持“靜止的狀態(tài)”，而是每天都分裂1次。這些干細(xì)胞保證了黏膜的持續(xù)更新，甚至在Tamoxifen誘導(dǎo)后6～12個(gè)月，都能看到小腸黏膜上以隱窩-絨毛為單位的藍(lán)色條帶[12]。Bmi-1是繼Lgr5后最新被發(fā)現(xiàn)的另一個(gè)可能的小腸干細(xì)胞標(biāo)記物[13]。它是Ploycomb抑制復(fù)合物的成分之一，該復(fù)合物主要是維持染色體的沉默狀態(tài)。在造血干細(xì)胞、神經(jīng)元和白血病干細(xì)胞的自我更新中，Bmi-1被發(fā)現(xiàn)起重要的作用。Sangiorgio和Capecchi通過(guò)構(gòu)建與Lgr5類似的Bmi-Cre-ER動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)Bmi-1陽(yáng)性的細(xì)胞同樣也能夠重建小腸上所有的成熟上皮細(xì)胞。但是，它與Lgr5不同的是，Bmi-1陽(yáng)性細(xì)胞最初是出現(xiàn)在＋4位，同時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞只能在近端小腸的10﹪的隱窩看到。Bmi-1是不是就是之前Potten看到的＋4位的DNA標(biāo)記物滯留細(xì)胞，或者Bmi-1和Lgr5標(biāo)記的是不是同一種小腸干細(xì)胞，這些問(wèn)題還需要進(jìn)一步的研究證明。但小腸干細(xì)胞特異性標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)，使小腸干細(xì)胞的研究翻開(kāi)了新的一頁(yè)。

五、維持小腸干細(xì)胞更新和促進(jìn)細(xì)胞分化的信號(hào)通路

（一）小腸上皮細(xì)胞增殖的原動(dòng)力—Wnt信號(hào)通路

Wnt信號(hào)是維持小腸上皮細(xì)胞持續(xù)更新的主要?jiǎng)恿Α＿@個(gè)在生物進(jìn)化史上相對(duì)保守的信號(hào)通路，其核心成分是beta-catenin。在沒(méi)有Wnt信號(hào)刺激的時(shí)候，細(xì)胞內(nèi)的beta-catenin和一個(gè)降解復(fù)合物所結(jié)合。這個(gè)復(fù)合物包含有腫瘤抑制物APC(adenomatous polyposis coli)、糖原合成激酶GSK3-beta、酪氨酸激酶I和axin，它們結(jié)合細(xì)胞漿內(nèi)游離的beta-catenin，使beta-catenin磷酸化，進(jìn)而被蛋白酶體降解。當(dāng)Wnt蛋白和它的受體Frizzled和LRP結(jié)合時(shí)，beta-catenin降解復(fù)合物即被失活，beta-caenin被釋放出來(lái)。在細(xì)胞內(nèi)積聚的beta-catenin進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子/淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子(T cell factor/lymphocyte enhancer factor,TCF/LEF)結(jié)合，從而啟動(dòng)一系列與增殖相關(guān)的基因，如c-myc等。一系列實(shí)驗(yàn)證明了Wnt信號(hào)通路是小腸黏膜維持其增殖狀態(tài)的基礎(chǔ)。當(dāng)用各種方法使Wnt信號(hào)失活時(shí)，如將轉(zhuǎn)錄因子TCF4失活后，小腸隱窩的增殖細(xì)胞將完全消失[14]。使上皮細(xì)胞持續(xù)表達(dá)一種Wnt信號(hào)抑制劑Dkk1后，上皮細(xì)胞增殖會(huì)大量減少，同時(shí)伴隨著隱窩的消失[15]。相反情況下，如將Wnt信號(hào)通路上的某一成分持續(xù)表達(dá)，那小腸的增殖將會(huì)失控。這種情況的典型就是腫瘤抑制物APC基因的失活和突變。目前認(rèn)為，APC基因的缺失是人結(jié)直腸癌發(fā)病過(guò)程中的起始事件之一。在人的腸道息肉中，也常能在發(fā)現(xiàn)增殖過(guò)度的隱窩細(xì)胞內(nèi)，APC基因發(fā)生了丟失或失活[16]。在APCmin/+小鼠體內(nèi)，它的一個(gè)APC等位基因已經(jīng)發(fā)生了突變。如果另外一個(gè)正常的等位基因也發(fā)生突變或失活的話，那發(fā)生突變的所在腸段將會(huì)發(fā)生腺瘤[17]。在小腸黏膜上，beta-catenin在絨毛-隱窩軸上都有表達(dá)。但在絨毛細(xì)胞里，beta-catenin只位于胞膜下；而在隱窩下1/3，即干細(xì)胞所在區(qū)域，beta-catenin則主要在細(xì)胞核內(nèi)。只有在細(xì)胞核內(nèi)的betacatenin才具有轉(zhuǎn)錄活性。beta-catenin的分布特性說(shuō)明小腸干細(xì)胞需要持續(xù)的Wnt信號(hào)來(lái)維持其快速的分裂活動(dòng)。

（二）小腸上皮細(xì)胞分化的各種信號(hào)

干細(xì)胞及其子代細(xì)胞在它的生命周期中經(jīng)常需要在“自我更新”和“分化成熟”之間做出選擇[18]。“自我更新”意味著干細(xì)胞通過(guò)分裂來(lái)產(chǎn)生新的干細(xì)胞，以此來(lái)補(bǔ)充因?yàn)榉只鴵p失的干細(xì)胞?！胺只墒臁眲t意味著細(xì)胞停止分裂并逐步成為某一成熟細(xì)胞。當(dāng)隱窩底部的干細(xì)胞在Wnt信號(hào)的刺激下分裂時(shí)，產(chǎn)生的細(xì)胞一部分繼續(xù)留在隱窩底部，維持干細(xì)胞的數(shù)量，另一部分開(kāi)始加速增殖，成為短暫增殖細(xì)胞。這些細(xì)胞在分裂的同時(shí)緩慢地向絨毛頂端移動(dòng)，在離開(kāi)隱窩后，這些細(xì)胞將停止分裂，逐漸獲得成熟細(xì)胞的特征。

1.Notch信號(hào)通路-吸收型細(xì)胞和分泌型細(xì)胞的分水嶺 小腸上的成熟細(xì)胞的類型共有4種：占絕大多數(shù)的腸吸收細(xì)胞，占10﹪的杯狀細(xì)胞、占1﹪的腸內(nèi)分泌細(xì)胞和永遠(yuǎn)位于隱窩底部的潘氏細(xì)胞。上述4類細(xì)胞又可根據(jù)細(xì)胞起源歸為兩大類：吸收型細(xì)胞和分泌型細(xì)胞。杯狀細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞和潘氏細(xì)胞均屬分泌型細(xì)胞。當(dāng)原始的增殖細(xì)胞開(kāi)始分化時(shí)，它首先要在這兩類細(xì)胞之間作出選擇。Notch信號(hào)通路是控制這一選擇的主要信號(hào)。Notch主要在隱窩內(nèi)表達(dá)，它傳導(dǎo)的是一種側(cè)向抑制的信號(hào)，其作用是使相鄰的2個(gè)未分化細(xì)胞分別向2個(gè)不同的方向分化成熟。這一信號(hào)通路是通過(guò)兩個(gè)相鄰的細(xì)胞起作用的。Notch是一種受體蛋白，它和Notch的配體(Jagged/Delta)均是膜結(jié)合蛋白。只有當(dāng)具有這2個(gè)蛋白的2個(gè)細(xì)胞相接觸時(shí)，配體才會(huì)與Notch結(jié)合，激活Notch信號(hào)通路。Notch信號(hào)激活后，細(xì)胞內(nèi)的gamma-secreatase將被釋放，切斷Notch受體的胞內(nèi)段NICD，游離后的NICD將進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子RBP-J/CSL結(jié)合在一起，啟動(dòng)相應(yīng)基因的表達(dá)。Notch的靶基因之一是Hes1，它的蛋白產(chǎn)物是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，它能夠抑制基因Math1的表達(dá)。表達(dá)Math1是分泌型細(xì)胞的前體細(xì)胞的特征之一。將小鼠的Math1變異后，小腸上皮上的所有分泌型細(xì)胞將全部消失[19]。因此，當(dāng)一個(gè)細(xì)胞的Notch被相鄰細(xì)胞的配體Delta激活后，這個(gè)細(xì)胞將不能表達(dá)Math1，意味著它不能分化成為分泌型細(xì)胞，而只能成為吸收型細(xì)胞。而表達(dá)Delta的細(xì)胞才可能成為吸收型細(xì)胞。Notch信號(hào)并不會(huì)使細(xì)胞立即離開(kāi)細(xì)胞周期，它在決定細(xì)胞的分化方向的同時(shí)也維持著細(xì)胞的快速增殖狀態(tài)。當(dāng)通過(guò)使用gamma-secretase抑制劑和敲除RBP來(lái)完全抑制住Notch的作用后，隱窩里的增殖細(xì)胞會(huì)完全被分化成熟的杯狀細(xì)胞所取代[20]。而將NICD條件性過(guò)量表達(dá)后，分泌型細(xì)胞會(huì)相應(yīng)減少；同時(shí)，小腸隱窩的增殖細(xì)胞卻增多了[21]。然而，Notch過(guò)度激活所導(dǎo)致的黏膜過(guò)度增殖的現(xiàn)象只有在Wnt信號(hào)有活性的隱窩才會(huì)出現(xiàn)。但在絨毛上過(guò)度表達(dá)Notch后，已分化的成熟細(xì)胞并不能回到其之前的增殖活躍狀態(tài)，其細(xì)胞內(nèi)的beta-catenin也沒(méi)有發(fā)生核轉(zhuǎn)移[22]。上述現(xiàn)象說(shuō)明Notch并不能反向激活Wnt，Notch可能只是Wnt下游的分化信號(hào)之一。當(dāng)細(xì)胞在Notch作用下向分泌型細(xì)胞的分化后，細(xì)胞還將在杯狀細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞和paneth細(xì)胞這三類細(xì)胞之間做出選擇。這時(shí)，表達(dá)Gfi1的細(xì)胞將向杯狀細(xì)胞和paneth細(xì)胞的方向分化[23]，而表達(dá)Neurogenin3的細(xì)胞將向腸內(nèi)分泌細(xì)胞方向分化[24]。

2.位于增殖中心惟一的成熟細(xì)胞Paneth細(xì)胞的分化 當(dāng)細(xì)胞決定向分泌型細(xì)胞分化后，杯狀細(xì)胞和腸內(nèi)分泌細(xì)胞的前體將向絨毛頂端移行和分化。而Paneth細(xì)胞的前體則是向隱窩底部移動(dòng)。成熟的Paneth細(xì)胞位于隱窩的最底部，與小腸干細(xì)胞相鄰。它的分化成熟是直接依賴于Wnt信號(hào)的。當(dāng)將Wnt信號(hào)的抑制物APC失活后，Paneth細(xì)胞將大量增多。Paneth細(xì)胞不同與其他成熟細(xì)胞的位置，源自Wnt的靶基因之一EPHB3的表達(dá)。Ephrin B1、EPHB2和EPHB3是在細(xì)胞膜上表達(dá)的一對(duì)配、受體。表達(dá)配體ephrin的細(xì)胞和表達(dá)受體EPHB2或EPHB3的細(xì)胞會(huì)互相排斥，當(dāng)相鄰的不同細(xì)胞各自表達(dá)某一種配體或受體時(shí)，不同細(xì)胞之間將形成明確的分界線。在小腸，隱窩內(nèi)的Paneth細(xì)胞表達(dá)EPHB3，隱窩底部的其他細(xì)胞表達(dá)EPHB2，而Ephrin B1只在絨毛上表達(dá)[25]。因此，當(dāng)Paneth細(xì)胞在Wnt的信號(hào)下表達(dá)EPHB3時(shí)，EPHB和Ephrin的排斥力使Paneth細(xì)胞只能向隱窩底部移動(dòng)。當(dāng)將EPHB2和EPHB3基因刪除后，隱窩內(nèi)Paneth細(xì)胞和其他增殖細(xì)胞將不再局限在隱窩里而遍布整個(gè)隱窩-絨毛軸，同時(shí)表達(dá)Ephrin的絨毛細(xì)胞也會(huì)在隱窩里出現(xiàn)[25]。這種分界現(xiàn)象不僅出現(xiàn)在生理情況下，在結(jié)腸癌中，癌細(xì)胞如果有EPHB基因失活，其腫瘤將有更強(qiáng)的侵襲性[26]。

（三）放射線損傷后小腸干細(xì)胞的細(xì)胞周期變化

由于小腸上皮細(xì)胞快速增殖的特點(diǎn)，它對(duì)放射線尤其敏感。即使較低的放射線劑量也能造成上皮細(xì)胞細(xì)胞周期的明顯變化。在給予小鼠8 Gy的全身照射后，小腸隱窩里尤其是底部的上皮細(xì)胞會(huì)在短時(shí)間內(nèi)大量表達(dá)P53。P53作為放射損傷后細(xì)胞應(yīng)激的典型代表，能引起一系列諸如細(xì)胞周期停止、凋亡或細(xì)胞衰老化的事件。小腸上皮細(xì)胞在放射線誘發(fā)的P53增多以后，其下游的細(xì)胞周期調(diào)控因子P21和促凋亡蛋白PUMA會(huì)在上皮細(xì)胞內(nèi)隨著升高[27]。隱窩內(nèi)的增殖細(xì)胞會(huì)離開(kāi)細(xì)胞周期進(jìn)行DNA修復(fù)；倘若細(xì)胞認(rèn)為DNA無(wú)法修復(fù)，那該細(xì)胞將發(fā)生凋亡，以防止不穩(wěn)定的DNA帶入子代細(xì)胞中。如P53的結(jié)合蛋白53BP1即有維持細(xì)胞多倍體穩(wěn)定性的特點(diǎn)。在53BP1基因敲除的情況下，小腸上皮細(xì)胞對(duì)放射線導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡并沒(méi)有發(fā)生改變，但卻在放射后48h出現(xiàn)了很多4倍體或8倍體的巨核細(xì)胞[28]。因此，P53在維護(hù)上皮細(xì)胞DNA穩(wěn)定性方面起重要的作用。雖然放射后誘發(fā)的P53信號(hào)通路使DNA受損的細(xì)胞大量死亡。但若將P53敲除后，其小腸上皮細(xì)胞的抗放射性并沒(méi)有相應(yīng)的提高。P53-/-小鼠的小腸在經(jīng)過(guò)放射后短時(shí)間仍能持續(xù)增殖，但之后即開(kāi)始大量死亡[29]?？梢?jiàn)細(xì)胞在DNA受損的情況下持續(xù)增殖，對(duì)細(xì)胞本身是有害的。但是，其中的特例是PUMA基因敲除的小鼠。當(dāng)促凋亡蛋白PUMA不存在后，P53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡將不能有效執(zhí)行，細(xì)胞在放射損傷后只能通過(guò)P21途徑來(lái)修復(fù)DNA。這種情況下，該轉(zhuǎn)基因小鼠的小腸抗放射性明顯增加[27]。上述現(xiàn)象為臨床上使用藥物來(lái)提高組織的抗放射能力提供了可能性。如果能找到一種藥物，能夠阻斷類似PUMA的促凋亡蛋白的表達(dá)，那就能抑制大大提高小腸的抗放射能力，從而減輕腹腔放療引起的副作用，如降低發(fā)生放射性腸炎的發(fā)病率。然而，實(shí)際情況要復(fù)雜得多。小腸組織在放射線照射后，具有靶點(diǎn)轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)。在低劑量下，小腸上皮對(duì)放射線最敏感的不是上皮細(xì)胞，而是小腸上的血管內(nèi)皮細(xì)胞。這些細(xì)胞比上皮細(xì)胞更早地發(fā)生凋亡，同時(shí)，保守血管內(nèi)皮細(xì)胞能顯著延長(zhǎng)放射后生存時(shí)間[30]。而在高劑量或者阻斷放射線對(duì)血管內(nèi)皮損傷(使用藥物)的情況下，放射線的靶點(diǎn)將會(huì)轉(zhuǎn)移至上皮細(xì)胞[31]。雖然后者的情況并不常見(jiàn)，但這個(gè)現(xiàn)象提示，由于小腸復(fù)雜的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，針對(duì)小腸進(jìn)行的放射保護(hù)需要考慮多方面的因素。就針對(duì)PUMA的靶向治療來(lái)說(shuō)，敲除PUMA對(duì)放射線和血管內(nèi)皮的損傷并沒(méi)有直接影響[27]。

六、小腸干細(xì)胞的微環(huán)境

干細(xì)胞的微環(huán)境是持續(xù)干細(xì)胞自我更新和分裂成熟性質(zhì)的一種特殊的組織結(jié)構(gòu)。干細(xì)胞只有在這樣的環(huán)境下才能維持其干細(xì)胞的功能。小腸干細(xì)胞位于隱窩底部，與其有密切接觸除了黏膜細(xì)胞本身，就是黏膜下的間充質(zhì)。當(dāng)小腸干細(xì)胞在強(qiáng)烈的Wnt信號(hào)刺激下快速分裂時(shí)，需要有抑制性信號(hào)將這種劇烈的增殖活動(dòng)局限在隱窩里，并時(shí)刻控制細(xì)胞的增殖速度。在這種情況下，黏膜和間充質(zhì)之間的信號(hào)反饋提供了調(diào)節(jié)的信號(hào)。這樣的信號(hào)反饋回路包括黏膜給間充質(zhì)的信號(hào)和間充質(zhì)反饋給黏膜的信號(hào)。Sonic Hedgedog和Indian Hedgedog是黏膜傳給間充質(zhì)信號(hào)的代表之一。SHH和IHH只在黏膜細(xì)胞表達(dá)，它們的受體Patched1和Patched2只在間充質(zhì)表達(dá)，當(dāng)黏膜上SHH/IHH激活其受體后，間充質(zhì)細(xì)胞反饋性地給黏膜一種抑制增殖的信號(hào)，BMP就是其中的代表之一。BMP在間充質(zhì)細(xì)胞表達(dá)后，通過(guò)在黏膜細(xì)胞上的受體BMPR1A，激活下游的效應(yīng)物SMAD1、SMAD5和SMAD8，由此抑制黏膜細(xì)胞的增殖。當(dāng)將黏膜上的受體BMPR1A失活后，隱窩的面積會(huì)擴(kuò)大，其內(nèi)部的增殖細(xì)胞會(huì)大量增加[32]。而在幼年性息肉病中常常能發(fā)現(xiàn)BMPR1A和SMAD4的變異[33]。然而，為了不讓這種抑制性信號(hào)影響隱窩正常的增殖活動(dòng)，在隱窩的局部表達(dá)有BMP信號(hào)的抑制物noggin。通過(guò)它來(lái)抑制黏膜－間充質(zhì)的信號(hào)回路，以維持隱窩底部強(qiáng)烈的增殖活動(dòng)[33]。

七、腸道腫瘤干細(xì)胞和小腸干細(xì)胞的關(guān)系

繼干細(xì)胞的概念出來(lái)以后，腫瘤干細(xì)胞的概念也逐步被人們接受。目前認(rèn)為，腫瘤組織同樣也是由核心地位的腫瘤干細(xì)胞發(fā)育而來(lái)的。當(dāng)腫瘤組織在放療或化療后，部分腫瘤組織將壞死，而如果腫瘤干細(xì)胞還存在，那腫瘤仍然可以再生。這可能是腫瘤復(fù)發(fā)的原因之一。腫瘤干細(xì)胞同樣具有特異性的標(biāo)記物。目前認(rèn)為，CD133是結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記物之一[34]。在患者的腫瘤組織分離出的CD133陽(yáng)性的細(xì)胞比一般的腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的腫瘤再生能力。有人使用與Lgr5類似的轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)CD133陽(yáng)性的小腸黏膜細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)示蹤，發(fā)現(xiàn)CD133標(biāo)記的細(xì)胞和Lgr5細(xì)胞一樣能夠再生隱窩－絨毛軸，部分CD133陽(yáng)性細(xì)胞還同時(shí)表達(dá)Lgr5；而將這群細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源性beta-catenin持續(xù)表達(dá)后，這些細(xì)胞最終能夠形成小腸腺瘤[35]。說(shuō)明表達(dá)CD133的細(xì)胞有明顯的腫瘤易感性。但是，表達(dá)CD133的細(xì)胞不僅僅有小腸干細(xì)胞，在隱窩內(nèi)部的短暫增殖細(xì)胞也表達(dá)CD133[36]。因此，上述現(xiàn)象并不能明確腫瘤干細(xì)胞是由小腸干細(xì)胞直接發(fā)生基因突變而來(lái)的，還是由小腸干細(xì)胞的子代細(xì)胞，如短暫增殖細(xì)胞發(fā)生基因調(diào)控失衡而生的。后來(lái)，另一組實(shí)驗(yàn)室使腫瘤抑制物APC只在Lgr5陽(yáng)性細(xì)胞里失活，即只在小腸干細(xì)胞水平持續(xù)激活Wnt信號(hào)，發(fā)現(xiàn)小腸腺瘤在APC失活后3～5 d里即可產(chǎn)生。同時(shí)，他們又將短暫增殖細(xì)胞內(nèi)的APC失活，發(fā)現(xiàn)腫瘤并不能形成[37]。因此，腫瘤發(fā)生所需要的基因突變只有在干細(xì)胞水平發(fā)生，才能產(chǎn)生真正的腫瘤干細(xì)胞，進(jìn)而形成腫瘤。

八、小腸干細(xì)胞的研究的發(fā)展趨勢(shì)

既往的研究由于干細(xì)胞標(biāo)記物遲遲沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，使得小腸干細(xì)胞的研究進(jìn)展緩慢。而由于沒(méi)有標(biāo)記物，小腸干細(xì)胞的體外培養(yǎng)很難開(kāi)展。以前對(duì)小腸黏膜細(xì)胞進(jìn)行體外分離、培養(yǎng)的嘗試，常常因?yàn)轲つぜ?xì)胞離開(kāi)了其所依賴的間充質(zhì)而發(fā)生死亡。最近，一個(gè)新的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)將Lgr5陽(yáng)性的小腸干細(xì)胞從體內(nèi)分離后，給予其足量的Wnt刺激物R-rpondin1、表皮生長(zhǎng)因子和noggin，在層黏連蛋白豐富的基質(zhì)膠培養(yǎng)基上培養(yǎng)一周后，這些細(xì)胞就能形成隱窩樣的結(jié)構(gòu)[38]。在對(duì)這些隱窩樣的結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步的分析，發(fā)現(xiàn)在這些細(xì)胞團(tuán)中，生長(zhǎng)有全部類型的小腸成熟細(xì)胞。這樣成功的體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，預(yù)示著小腸干細(xì)胞體外擴(kuò)增的可能。對(duì)于小腸干細(xì)胞的各種性質(zhì)研究將不僅限于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)，將健康的小腸干細(xì)胞移植入損失的黏膜內(nèi)來(lái)補(bǔ)充不足的腸功能也將在不久的將來(lái)實(shí)現(xiàn)。

1 Marshman E,Booth C,Potten CS.The intestinal epithelial stem cell[J].Bioessays,2002,24(1):91-98.

2 Potten CS.Extreme sensitivity of some intestinal crypt cells to X and irradiation[J].Nature,1977,269(5628):518-521.

3 Potten CS,Owen G,Booth D.Intestinal stem cells protect their genome by selective segregation of template DNA strands[J].J Cell Sci,2002,115(11):2381-2388.

4 Kiel MJ,He S,Ashkenazi R,et al.Haematopoietic stem cells do not asymmetrically segregate chromosomes or retain BrdU[J].Nature,2007,449(7159):238-242.

5 Cheng H,Le blond CP.Origin,differentiation and renewal of the four main epithelial cell types in the mouse small intestine.I.Columnar cell[J].Am J Anat,1974a,141(4):461-479.

6 Bjerknes M,Cheng H.Clonal analysis of mouse intestinal epithelial progenitors[J].Gastroenterology,1999,116(1):7-14.

7 Potten CS,Booth C,Tudor GL,et al.Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage marker;musashi-1[J].Differentiation,2003,71(1):28-41.

8 He XC,Zhang J,Tong WG,et al.BMP signaling inhibits intestinal stem cell self-renewal through suppression of Wnt- -catenin signaling[J].Nat Genet,2004,36(10):1117-1121.

9 Gregorieff A,Pinto D,Begthel H,et al.Expression pattern of Wnt signaling components in the adult intestine[J].Gastroenterology,2005,129(2):626-638.

10 Giannakis M,Stappenbeck TS,Mills JC,et al.Molecular properties of adult mouse gastric and intestinal epithelial progenitors in their niches[J].J Biol Chem,2006,281(16):11292-11300.

11 Barker N,van Es JH,Kuipers J,et al.Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5[J].Nature,2007,449(7165):1003-1007.

12 Barker N,van Es JH,Jaks V,et al.Very Long-term Self-renewal of Small Intestine,Colon,and Hair Follicles from Cycling Lgr5+ve Stem Cells[J].Cold Spring Harb Symp Quant Biol,2008,73:351-356.

13 Sangiorgio E,Capecchi MR.Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells[J].Nat.Genet.,2008,40(7):915-920..

14 Korinek V,Barker N,Moerer P,et al.Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4[J].Nature Genet,1998,19(4):379-383.

15 Pinto D,Gregorieff A,Begthel H,et al.Canonical Wnt signals are essential for homeostasis of the intestinal epithelium[J].Genes Dev,2003,17(14):1709-1713.

16 Morin PJ,Sparks AB,Korinek V,et al.Activation of β-catenin–Tcf signaling in colon cancer by mutations in β-catenin or APC[J].Science,1997,275(5307):1787-1790.

17 Su LK,Kinzler KW,Vogelstein B,et al.Multiple intestinal neoplasia caused by a mutation in the murine homolog of the APC gene[J].Science,1992,256(5307):668-670.

18 Orford KW,Scadden DT.Deconstructing stem cell self-renewal: genetic insights into cell-cycle regulation[J].Nat Rev Genet,2008,9(2):115-128.

19 Yang Q,Bermingham NA,Finegold MJ,et al.Requirement of Math1 for secretory cell lineage commitment in the mouse intestine[J].Science,2001,294(5549):2155-2158.

20 van Es JH,van Gijn ME,Riccio O,et al.Notch/γ-secretase inhibition turns proliferative cells in intestinal crypts and adenomas into goblet cells[J].Nature,2005,435(7044):959-963.

21 Stanger BZ,Datar R,Murtaugh LC,et al.Direct regulation of intestinal fate by Notch[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(35):12443-12348.

22 Zecchini V,Domaschenz R,Winton D,et al.Notch signaling regulates the differentiation of post-mitotic intestinal epithelial cells[J].Genes Dev,2005,19(14):1686-1691.

23 Shroyer NF,Wallis D,Venken KJ,et al.Gfi1 functions downstream of Math1 to control intestinal secretory cell subtype allocation and differentiation[J].Genes Dev,2005,19(20):2412-2417.

24 Jenny M,Uhl C,Roche C,et al.Neurogenin3 is differentially required for endocrine cell fate specification in the intestinal and gastric epithelium[J].EMBO J,2002,21(23):6338-47.

25 Batlle E,Henderson JT,Begthel H,et al.β-Catenin and TCF mediate cell positioning in the intestinal epithelium by controlling the expression of EphB/ephrinB[J].Cell,2002,111(2):251-263 .

26 Batlle E,Bacani J,Begthel H,et al.EphB receptor activity suppresses colorectal cancer progression[J].Nature,2005,435(7045): 1126-1130.

27 Qiu W,Carson-Walter EB,Liu H,et al.PUMA regulates intestinal progenitor cell radiosensitivity and gastrointestinal syndrome[J].Cell Stem Cell,2008,2(6):576-583.

28 Clarke AR,Jones N,Pryde F,et al.53BP1deficiency in intestinal enterocytes does not alter the immediate response to ionizing radiation,but leads to increased nuclear area consistent with polyploidy[J].Oncogene,2007,26(43):6349-6355.

29 Komarova EA,Kondratov RV,Wang K,et al.Dual effect of p53 on radiation sensitivity in vivo: p53 promotes hematopoietic injury,but protects from gastro-intestinal syndrome in mice[J].Oncogene,2004,23(19):3265-3271.

30 Paris F,Fuks Z,Kang A,et al.Endothelial apoptosis as the primary lesion initiating intestinal radiation damage in mice[J].Science,2001,293(5528):293-297.

31 Ch’ang HJ,Maj JG,Paris F,et al.ATM regulates target switching to escalating doses of radiation in the intestines[J].Nat Med,2005,11(5):484-490.

32 Howe JR,Roth S,Ringold JC,et al.Mutations in the SMAD4/DPC4 gen in juvenile polyposis[J].Science,1998,280(5366):1086-1088.

33 Haramis AP,Begthel H,van der Born M,et al.De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine[J].Science,2004,303(5664):1684-1686.

34 Mizrak D,Brittan M,Alison MR.CD133: molecule of the moment[J].J Pathol,2008,214(1):3-9.

35 Zhu L,Gibson P,Currle D.Prominin 1 marks intestinal stem cells that are susceptible to neoplastic transformation[J].Nature,2009,457(7229):603-607.

36 Snippert HJ,van Es JH,van den Born M,et al.Prominin-1/CD133 marks stem cells and early progenitors in mouse small intestine[J].Gastroenterology,2009,136(7):2187-2194.e1.

37 Barker N,Ridgway RA,van Es JH,et al.Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer[J].Nature,2009,57(7229):608-611.

38 Sato T,Vries RG,Snippert HJ,et al.Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche[J].Nature,2009,459(7244):262-265.