馬思泉

山東省菏澤市第二人民醫(yī)院胸外科，山東菏澤 274005

乳腺癌近年來發(fā)病率呈直線上升趨勢，而且發(fā)病年齡趨于年輕化，而遠處轉(zhuǎn)移是患者的主要死亡原因。目前患者體內(nèi)存在的微小轉(zhuǎn)移癌灶尚難發(fā)現(xiàn)，早期篩選出具有轉(zhuǎn)移危險性的患者，予以徹底控制是提高乳腺癌療效的關(guān)鍵。本研究旨在探討組織蛋白酶D（cathepsin D，Ca-D）和E-鈣黏附蛋白（epithelial Cadherin， E-Ca）在乳腺癌組織中的表達情況，并預測其在預后估計中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集筆者所在醫(yī)院2002～2008年手術(shù)切除后經(jīng)病理證實，且有3年以上隨訪資料的女性乳腺癌患者106例作為研究對象，同時選取乳腺增生性病變即纖維腺瘤作為對照?；颊吣挲g21～81歲，采取乳腺癌根治或改良根治術(shù)?；颊咝g(shù)前未經(jīng)過任何治療，術(shù)后進行正規(guī)化療。

1.2 分組

按照同側(cè)腋窩淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)移個數(shù)分為3組：無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者為第1組，轉(zhuǎn)移個數(shù)1～3個（含3個）者為第2組，轉(zhuǎn)移個數(shù)4個或4個以上者為第3組。

1.3 染色方法及結(jié)果判斷標準

采用鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶法（S-P法）染色法（S-P試劑盒及一抗均購自福州邁新公司），DAB顯色，實驗步驟嚴格按照說明書進行。用已知陽性切片作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷

采用雙盲法。陽性結(jié)果呈棕黃色顆粒狀，隨機選取10個高倍視野，計算著色腫瘤細胞占細胞總數(shù)的百分比。按照參考文獻對不同抗體染色結(jié)果進行判斷，CD34染色標記血管內(nèi)皮細胞，先在低倍鏡下找到新生血管密集區(qū)，在200倍視野下觀察、計數(shù)5個視野下血管總數(shù)，取其平均值作為該患者的微血管密度（microvessel density，MVD）。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS1.0統(tǒng)計軟件處理。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

以觀察滿3年時患者生存狀態(tài)為判斷依據(jù)，其中無瘤存活者55例（文中以后稱無復發(fā)組），出現(xiàn)局部復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移者51例（文中以后稱復發(fā)組）。腫瘤發(fā)生部位左側(cè)（61例）多于右側(cè)（45例）。混合性癌12例，浸潤性導管癌77例，浸潤性小葉癌17例（分析數(shù)據(jù)時將混合型和小葉癌合并），浸潤性導管癌明顯多于小葉癌，兩者比例約4.5∶1。

2.2 E-Ca在乳腺癌組織中的表達及臨床意義

2.2.1 E-Ca蛋白在乳腺組織中的表達 E-Ca在正常乳腺癌組織內(nèi)呈強表達，在癌組織內(nèi)表達減弱。E-Ca的陽性率在浸潤性小葉癌中為51.7%（15/29），導管癌中為76.4%（55/72），兩組差異有統(tǒng)計學意義。

2.2.2 E-Ca蛋白表達相關(guān)因素 E-Ca蛋白表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈相關(guān)趨勢，低表達者容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶E-Ca蛋白表達降低。E-Ca蛋白表達與復發(fā)、部位、腫瘤大小、生存期均無關(guān)。

2.3 Ca-D在乳腺癌組織中的表達及臨床意義

2.3.1 Ca-D在乳腺癌組織內(nèi)的表達 Ca-D在正常乳腺癌組織內(nèi)無表達或微弱表達，在腫瘤組織內(nèi)表達明顯增強。Ca-D在乳腺腫瘤實質(zhì)細胞和間質(zhì)細胞內(nèi)都有不同程度的表達，不同腫瘤表達部位有所不同。

2.3.2 Ca-D在乳腺癌組織不同部位表達相關(guān)因素 分別觀察Ca-D在乳腺腫瘤實質(zhì)細胞和間質(zhì)細胞內(nèi)的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①間質(zhì)內(nèi)Ca-D的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復發(fā)呈正相關(guān)：低表達組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為50%（12/24），復發(fā)率為33.3%（8/24），中表達組轉(zhuǎn)移率為60.7%（17/28），復發(fā)率為42.9%（12/28），強表達組轉(zhuǎn)移率為79.1%（34/43），復發(fā)率為69.8%（30/43）； 強表達組轉(zhuǎn)移、復發(fā)率高，與生存期呈負相關(guān)。②腫瘤實質(zhì)內(nèi)Ca-D的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、生存狀態(tài)及生存期無關(guān)。

Ca-D表達與腫瘤大小、病理類型、年齡無關(guān)。

2.4 乳腺癌組織中MVD的臨床意義

2.4.1 MVD與生存狀態(tài)的關(guān)系 存活組MVD最小值43，最大值158，平均值79.8947，標準差為25.4418；復發(fā)組MVD最小值36，最大值2.6，平均值103.1136，標準差為33.3635，兩組差異有統(tǒng)計學意義（F=12.246，P=0.001）。

2.4.2 MVD與生存期的關(guān)系 MVD與生存期存在負相關(guān)（r=-0.301，P=0.006），MVD 越高，生存期越短。

MVD與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑、病理類型均無相關(guān)性。

2.5 nm23-H1在乳腺組織中的表達及其生物學意義

2.5.1 nm23-H1蛋白在乳腺組織內(nèi)的表達 nm23-H1蛋白在良性乳腺病變內(nèi)呈強表達，在乳腺癌組織中表達下降，在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織可見強表達，尤其是在轉(zhuǎn)移或復發(fā)病灶甚至無表達。

2.5.2 nm23-H1蛋白表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 nm23-H1低表達組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為83.3%（25/30），高表達組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為54.5%（24/44），nm23-H1蛋白表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)。

2.5.3 nm23-H1蛋白表達與生存狀態(tài)的關(guān)系 nm23-H1低表達組復發(fā)率為76.7%（23/30），高表達組復發(fā)率為40.9%（18/44）， 低表達組復發(fā)率高于高表達組。nm23-H1蛋白表達水平與復發(fā)呈負相關(guān)。

2.5.4 nm23-H1蛋白表達與生存期的關(guān)系 nm23-H1高表達

者存活時間長，低表達者存活時間短，nm23-H1蛋白表達與生存期呈正相關(guān)。

2.5.5 nm23-H1和腫瘤實質(zhì)內(nèi)Ca-D的關(guān)系 本實驗發(fā)現(xiàn)nm23-H1和腫瘤實質(zhì)內(nèi)Ca-D的表達存在相關(guān)性，兩者同時低表達者占12.5%（9/72），同時高表達者占47.2%（34/72），兩者呈正相關(guān)（r=0.264，P=0.025），目前尚未見該方面報道。

3 討論

3.1 E-鈣黏附蛋白和微血管密度與乳腺癌患者預后的關(guān)系

E-鈣黏附蛋白是一類介導細胞間粘連作用的跨膜糖蛋白，對維護上皮細胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整性起著重要作用。E-Ca表達下降或缺失，細胞間的相互粘附力下降，造成細胞容易分散而向外浸潤性生長，一旦獲得轉(zhuǎn)移的條件，就可以脫離原發(fā)灶而發(fā)生轉(zhuǎn)移[1]。乳腺癌患者的E-Ca的喪失與腫瘤的浸潤性、低分化和預后差有關(guān)[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，將E-Ca的cDNA轉(zhuǎn)染具有浸潤性的惡性腫瘤細胞株，則可抑制后者的移動。

本組資料未發(fā)現(xiàn)E-Ca與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠期預后的相關(guān)性，筆者認為E-Ca作為預測指標不理想。但其在浸潤性導管癌和小葉癌中的表達陽性率不同，可以在腫瘤分化比較差的情況下輔助鑒別診斷。

腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移是一個依賴血管的過程。乳腺癌是典型的血管依賴性腫瘤。當腫瘤體積超過1 ～ 2 mm3時，維持其繼續(xù)生長有賴于新生血管的生成。研究發(fā)現(xiàn)，隨著腫瘤微血管密度的增加，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等惡性潛能也明顯增加。Narita等[4]對100例乳腺癌患者進行多因素研究，分析其年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)受累狀況、雌激素受體、微血管、P53等9個因素與預后的關(guān)系，結(jié)果提示MVD在淋巴結(jié)陰性組中可獨立作為預后指標，但在淋巴結(jié)陽性組MVD與術(shù)后生存期無關(guān)。在無復發(fā)組中，MVD高低與淋巴結(jié)陽性和陰性患者術(shù)后長期生存都有良好的相關(guān)性。

本組實驗結(jié)果顯示MVD與生存狀態(tài)及生存期有關(guān)，MVD高患者容易出現(xiàn)復發(fā)和（或）轉(zhuǎn)移，生存期縮短。腫瘤組織內(nèi)MVD可作為一種新的反映腫瘤微血管形成強度與侵襲性必然聯(lián)系的生物學指標，作為腫瘤轉(zhuǎn)移的預報因子，判斷預后。

本實驗還發(fā)現(xiàn)MVD的高低與E-Ca的表達有相關(guān)性，E-Ca蛋白表達降低，MVD增高，可能是由于細胞之間黏附性降低，新生血管容易長入的緣故。

3.2 組織蛋白酶D和nm23-H1

Ca-D是一種含天冬氨酸的蛋白酶，正常情況下存在于細胞溶酶體內(nèi)，由雌激素誘導產(chǎn)生，具有直接消化細胞外間質(zhì)或間接破壞基底膜的作用，也可發(fā)揮生長因子的作用。在蛋白質(zhì)分解代謝和組織修復過程中可有少量分泌。臨床研究發(fā)現(xiàn)細胞生長失控時Ca-D分泌增加。這種異常分泌的蛋白酶是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)衰老退化從而導致癌細胞浸潤和擴散的主要原因。

很多臨床研究者認為Ca-D可以獨立作為預后值[5-6]，在淋巴結(jié)陰性的患者組中腫瘤間質(zhì)內(nèi)Ca-D呈中等至強陽性時，瘤細胞核分裂數(shù)目較高，組織學分級低，無病期及總生存期短[7]。腫瘤浸潤性越強，間質(zhì)反應越明顯，瘤細胞分泌生長因子刺激間質(zhì)細胞表達Ca-D，降解結(jié)締組織，有利于腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移，但相反的意見認為，在腫瘤細胞不表達或弱表達、在間質(zhì)中高表達可能提示預后較好[8]。

本組數(shù)據(jù)顯示組織蛋白酶D表達存在異質(zhì)性，只有間質(zhì)細胞Ca-D表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復發(fā)、生存期有關(guān)，高表達者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高、容易復發(fā)、生存期縮短。

nm23-H1是一種與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，多數(shù)研究結(jié)果表明乳腺癌組織中nm23-H1基因蛋白表達水平降低將增加腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移能力。本研究結(jié)果表明，59.5%的乳腺癌組織中nm23-H1基因表達較高，與國外文獻報道相近。nm23-H1基因低表達組患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為83.33%，復發(fā)率為76.67%，明顯高于nm23-H1蛋白高表達組（分別為54.55%和40.91%），nm23-H1蛋白表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤復發(fā)呈負相關(guān)，與生存期呈正相關(guān)[9-10]，而與患者的發(fā)病年齡、組織學分類、腫瘤大小無關(guān)。因此檢測nm23-H1基因表達可作為臨床預測乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移趨勢的重要參考指標之一[11]。

筆者還發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞Ca-D與nm23-H1蛋白表達水平呈正相關(guān)，支持腫瘤間質(zhì)內(nèi)Ca-D表達增高作為預后不良的判斷指標。

腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移是一個涉及多步驟、多因素的復雜過程，通過本研究筆者認為在乳腺癌細胞浸潤、轉(zhuǎn)移過程中，E-鈣黏附蛋白表達下降，細胞之間的黏附性、間質(zhì)內(nèi)微血管密度增高。這些新生血管把腫瘤細胞和循環(huán)系統(tǒng)直接連接起來，使腫瘤細胞賴以生長的物質(zhì)交換得以進行。此外新生血管還可以作為腫瘤轉(zhuǎn)移的通道，通過新生血管將原發(fā)癌細胞輸送到轉(zhuǎn)移靶器官。腫瘤細胞nm23-H1表達減弱，組織蛋白酶D分泌減弱，可能誘導間質(zhì)細胞Ca-D合成增多，降解結(jié)締組織，有利于腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移。利用乳腺癌患者手術(shù)切除標本進行免疫組化標記nm23-H1、MVD和Ca-D有助于預后的判斷。

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