張 琴（青島科技大學化工學院，山東 青島 266042）

0 引言

燃料乙醇近年來在國內(nèi)外得到了迅速發(fā)展，但目前基于糧食類淀粉質(zhì)原料的燃料乙醇，已經(jīng)引發(fā)了全球范圍內(nèi)的爭議。以各類農(nóng)林廢棄物為代表的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)［1］是地球上最豐富的資源，以其為原料生產(chǎn)燃料乙醇，不僅可以解決當前以糧食類淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)燃料乙醇產(chǎn)生的諸多問題，而且可以促進農(nóng)村經(jīng)濟發(fā)展。然而木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)水解糖［2］中含有不能被乙醇發(fā)酵性能優(yōu)良的釀酒酵母利用的、以木糖為主要成分的五碳糖，因此能夠高效利用木糖生產(chǎn)乙醇菌株的選育，是木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)資源生產(chǎn)燃料乙醇［3］的關(guān)鍵技術(shù)之一。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是乙醇發(fā)酵的優(yōu)良菌株，但缺乏木糖代謝途徑。通過代謝工程和基因工程構(gòu)造可利用木糖的工程釀酒酵母方面已有了許多研究。但一般乙醇產(chǎn)量低，副產(chǎn)物產(chǎn)量高。

為解決在釀酒酵母中利用木糖生產(chǎn)乙醇產(chǎn)量低副產(chǎn)物木糖醇［4］含量高，已經(jīng)進行了許多研究。獲得性能優(yōu)良的木糖發(fā)酵酵母是提高木糖發(fā)酵酵母與釀酒酵母原生質(zhì)體融合株木糖發(fā)酵性能的重要途徑。比如對其細胞膜上的轉(zhuǎn)運體進行改造，以提高細胞攝取木糖的能力。或者通過進化工程及馴化

手段對重組酵母或融合子進一步改良。

1 木糖的代謝途徑

不同微生物中木糖代謝途徑也不一樣，在許多真菌及酵母菌中經(jīng)過兩次氧化還原。D-木糖在輔因子NADPH和NAD+作用下就可以轉(zhuǎn)化為D-木酮糖。即木糖先在依賴NADPH的木糖還原酶（XR；EC1.1.1.21）的作用下生成木糖醇［5］，接著又在依賴NAD+的木糖醇脫氫酶（XDH；EC 1.1.1.9）的作用下氧化為D-木酮糖［6］。最后又在木酮糖激酶（XK；EC 2.7.1.17）作用下磷酸化生成5-磷酸D-木酮糖（X5P）［7］，而5-磷酸D-木酮糖又通過戊糖磷酸化途徑（PPP）進行下一步代謝，因該反應(yīng)中消耗ATP故反應(yīng)速率取決于供能和細胞的磷酸化。釀酒酵母不能利用木糖，但有可編碼XR（YHR104w，GRE3；et al.2002），XDH（YLR070c，ScXYL2；Richard et al.1999）和XK（XKS1；Yangand Jeffries 1997；Richard et al.2000）的基因，只是表達水平低，不能作用于木糖。

在大部分細菌中，D-木糖可以在木糖異構(gòu)酶（XI；EC 5.3.1.5）作用下直接生成D-木酮糖［8］。如在真菌中在XK作用下D-木糖可被磷酸化為D-木酮糖。據(jù)報道一些真菌和酵母菌都有XI活性。

2 XR和XDH的表達

基因XYL1［9］和XYL2［10］雜交表達在釀酒酵母中可形成XR和XDH為在釀酒酵母中進行木糖發(fā)酵提供了例證。盡管可通過厭氧發(fā)酵將木糖轉(zhuǎn)化為乙醇，但為了得到足夠的木糖仍需通氧，這會降低糖消耗速率，另外許多可進行木糖發(fā)酵的酵母菌會產(chǎn)生副產(chǎn)物木糖醇。這是因為依賴NADPH的XR和限制性依賴NAD的XDH酶之間的差異，盡管PsXR依賴NADPH但菌株P(guān).stipitis是同時擁有NADPH，NAD特性XR的少數(shù)酵母中的一種，在木糖發(fā)酵過程中會產(chǎn)生木糖醇。

在S.cerevisiae菌系表達PsXR和PsXDH的過程會產(chǎn)生大量的木糖醇這將會降低乙醇的產(chǎn)量［11］。故應(yīng)對S.cerevisiae進行改進，實驗表明XDH的相對含量比XR高就可以增加乙醇含量降低木糖醇的產(chǎn)量，最近研究還表明PsXR和PsXDH活性都高對于S.cerevisiae菌系產(chǎn)生足夠木糖有利。

3 XI表達

在S.cerevisiae中由xylA基因所控制表達的XI是很低的。研究表明從E.coli和Streptomyces rubiginosus中得到的xylA的雜交表達可產(chǎn)生加速形成活性蛋白的可溶性蛋白［12］。在S.cerevisiae中的不成功表達主要因為蛋白的錯誤折疊。表達在S.cerevisiae中第一個XI來自Thermus thermophilus，雖然對XI的遺傳性進行修復(fù)可以減少副產(chǎn)物木糖醇的產(chǎn)量，但這種酶在S.cerevisiae的生長條件下不利于酶最大活性的發(fā)揮。我們也可在S.cerevisiae內(nèi)建立了一些細菌和真菌的XI途徑，實際上一項最新研究表明一種從Clostridium phytofermentans中分離出來的高活性的XI已經(jīng)成功表達，它在S.cerevisiae中受木糖醇影響很小［13］。

引入XI途徑代替XR-XDH途徑是降低木糖醇產(chǎn)量的方法之一，XI不需要還原協(xié)同因子而且在木糖發(fā)酵過程中不會擾亂分子間還原反應(yīng)的平衡。比較發(fā)現(xiàn)XI途徑比XR-XDH途徑有更高的產(chǎn)量且副產(chǎn)物少，但XI途徑速率低。但是，XI要在強大引發(fā)劑的作用下才能進行表達。

4 利用S.cerevisiae的木糖利用系統(tǒng)改進乙醇發(fā)酵

作為S.cerevisiae引入的木糖向木酮糖的轉(zhuǎn)化途徑補充，為提高木糖轉(zhuǎn)化為乙醇的速率和產(chǎn)率，我們以采取措施對新陳代謝過程和基因進行改造，在這里介紹一下最重要的工程方法。主要包括XK的過表達，打破細胞間還原平衡，木糖轉(zhuǎn)化的工程化加強了ppp。

4.1 XK的表達

釀酒酵母可緩慢催化D-木糖，D-木酮糖的異構(gòu)化反應(yīng)。低木酮糖消耗量也可理解為低內(nèi)源XK活性，這會限制木糖發(fā)酵。Hoetal.（1998）［14］第一個培育了重組酵母菌，在它體內(nèi)XKSI編碼的從S.cerevisiae中提取的XK用一種酵母穿梭質(zhì)粒過表達，同時還有PsXR和PsXDH基因。由染色體PsXR，PsXDH，ScXR聯(lián)合表達的穩(wěn)定重組的釀酒酵母也已經(jīng)形成，這些重組酵母可以進行木糖發(fā)酵，葡萄糖和木糖輔酶發(fā)酵，但會略微降低乙醇產(chǎn)量。已經(jīng)有報道說ScXR基因過表達而PsXR，PsXDH正常表達也可以生產(chǎn)乙醇。盡管這些努力都對重組釀酒酵母木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇工業(yè)做出了改進，但木糖醇仍是重要的副產(chǎn)物。

對于XK活性水平，Ho et al.（1998）曾報道過ScXK基因的過表達，PsXR，PsXDH正常表達會增加乙醇產(chǎn)量并降低副產(chǎn)物木糖醇的產(chǎn)量，相反的Rodriguez-Pena et al.（1998）［15］的報道表明ScXK基因的過表達會抑制木酮糖產(chǎn)量，Johansson et al.（2001）［16］研究發(fā)現(xiàn)ScXK基因的過表達會增加乙醇產(chǎn)量卻大大降低釀酒酵母中的木糖的消耗，Jin et al.（2003）［17］發(fā)現(xiàn)高表達XYL3基因編碼的來自釀酒酵母的XK基因及高水平表達PsXR和PsXDH會抑制木糖細胞的生長而適當表達PsXR會促進細胞生長。PsXK比ScXK特異性好。在研究中XK的過表達沒表現(xiàn)出抑制作用，在Matsushika和Sawayama（2008）［18］研究中發(fā)現(xiàn)適中ScXK活性和高PsXR，PsXDH活性會增加乙醇產(chǎn)量并降低木糖醇產(chǎn)量但并沒有出現(xiàn)由于XK的過表達而引起的木糖細胞生長或產(chǎn)量降低現(xiàn)象。因此只有釀酒酵母中XK基因有序高表達才有利于木糖產(chǎn)乙醇條件優(yōu)化，因此只有在細胞異常積累X5P而缺少ATP條件下引起XK過表達會減少乙醇產(chǎn)量。

4.2 氧化還原平衡

PsXR和PsXDH之間由于輔酶不同而引起細胞內(nèi)氧化還原平衡的破壞會使木糖醇含量增加，為減少木糖發(fā)酵過程木糖醇形成。Jeppsson et al.（2002）［19］，構(gòu)建一種可表達PsXR和PsXDH的重組釀酒酵母，主要通過GND1和ZWF1基因降低PPP活性大大產(chǎn)出ScXK。這些基因編碼了產(chǎn)生了NADPH的6-磷酸葡萄糖脫氫酶及葡萄糖-6磷酸脫氫酶。與母體相比它們的突變體會有木糖消耗量低乙醇產(chǎn)量高的特性。

釀酒酵母不含有將NADH轉(zhuǎn)化為NADPH的轉(zhuǎn)氫酶，因此會造成細胞溶質(zhì)的NADH積累。從Azotobacter vinlandii提取的異源轉(zhuǎn)氫酶基因在釀酒酵母中的表達會降低木糖醇產(chǎn)量這可能由于轉(zhuǎn)氫酶反應(yīng)中形成的還原性NADH，因此利用轉(zhuǎn)氫酶反應(yīng)的途徑對木糖發(fā)酵是毫無意義的，另一方面，Verho［20］表明克魯圍酵母乳糖GDP—基因編碼了一個依賴NADP+的3-磷酸甘油醛脫氫酶，會增加乙醇的產(chǎn)量，GDP—的過表達伴隨著ZWF1基因的缺失，會造成乙醇含量的降低，

另一種減少木糖醇產(chǎn)量增加乙醇產(chǎn)量的比較有前途的途徑就是通過修改釀酒酵母中的輔酶或者利用蛋白質(zhì)工程修改XR或XDH，對于XR，Jeppsson報道［21］，通過表達突變基因減少NADPH，PsXDH和ScXK的親和性從而達到降低木糖醇含量增加乙醇含量的目的。幾種NADH依賴型PsXR突變劑例如K270R和R276H，據(jù)報道對乙醇和木糖醇含量的增加具有積極的作用［22］。此外，通過在輔酶結(jié)合區(qū)域中進行的多重定向突變以及引進一個鋅結(jié)合位點來增加它的熱穩(wěn)定性［23］，構(gòu)造了一種完全針對NADP+輔酶特性的反轉(zhuǎn)的幾種PsXDH突變劑，其中的一個四倍突變體ARSdR的對NADP+的KCAT/Km值是未突變酶的4500倍，而對于NAD+的KCAT/Km的值與未突變的基本相同。最后，供體控制的ARSdR突變劑的重組酵母可增加木糖生產(chǎn)乙醇的量［24］，并且可以降低木糖醇的含量，這可能主要與保持分子間的氧化平衡有關(guān)。

4.3 木糖運輸

由于缺乏木糖特異性運載體，釀酒酵母可通過利用非特異性的己糖運載體的易化擴散作用吸收木糖，該載體由HXT系列基因編碼［25］，這些載體對葡萄糖親和性高于木糖而轉(zhuǎn)運木糖的能力和糖親和力有關(guān)［26］。所以葡萄糖運輸會競爭性的抑制木糖運輸，在葡萄糖消耗完后木糖才被利用。因為釀酒酵母并沒有把木糖識別為可發(fā)酵碳源，所以運用異源的木糖特異性運載體就非常有用。

在針對所有己糖運載體的缺失突變中單個HXT基因的重新引入和表達強調(diào)了HXT4，HXT5，HXT7親和運載體的和Gal2作為木糖轉(zhuǎn)運蛋白的重要作用［27］。由于HXT5和HXT7只有在木糖作為唯一碳源條件下才會表達故它對木糖轉(zhuǎn)運更為重要。盡管有人嘗試通過HXT7和Gal2的過表達來提高木糖發(fā)酵效率，但無明顯作用。我們應(yīng)將致力于研究與轉(zhuǎn)運和發(fā)酵有關(guān)的蛋白體，應(yīng)關(guān)注這些基因如Agt1（可誘導(dǎo)的高親和性麥芽糖運載體），Snf3（控制葡萄糖運輸?shù)馁|(zhì)膜傳感器）。已有研究表明Agt1運載體是釀酒酵母中轉(zhuǎn)運麥芽三糖的有效因子［28］。

SUT1基因編碼的P.stipitis中的運載體在釀酒酵母中成功表達［29］，已有報道表明運載體在木糖中交互表達。此外葡萄糖木糖異化擴散運載體和葡萄糖木糖共輸運載體由來自假絲酵母的GXF1和GXF1表達［30］，在釀酒酵母中含有GXF1有更快的吸收木糖和更高的乙醇產(chǎn)率。這些重組運載體的表達提高了木糖發(fā)酵效率。

4.4 磷酸戊糖途徑

非氧化PPP是將木酮糖轉(zhuǎn)入糖酵解的唯一途徑。但在釀酒酵母中該途徑效率低且會造成PPP代謝產(chǎn)物積累，會降低木酮糖產(chǎn)量。此外釀酒酵母一般用己糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇，故非氧化PPP酶例如轉(zhuǎn)醛醇酶，轉(zhuǎn)酮醇酶，5-磷酸核酮糖3-差向異構(gòu)酶，5-磷酸核酮糖乙酮醇異構(gòu)酶的過表達均會加強該途徑。

內(nèi)在的轉(zhuǎn)醛醇酶基因和來自P.stipitis的TAL1基因過表達都會增加木糖產(chǎn)量［31］。相反，對來自P.stipitis得TKL1過表達會降低木糖產(chǎn)量［32］。有趣的是對于四種非氧化PPP基因RPE1，RKI1，TAL1和TKL1的過表達會促進木酮糖消耗［33］。

非氧化PPP酶過表達及內(nèi)源XKS1過表達，GRE3的缺失都會促進木糖生長［34］。不僅在含有微生物性XI，而且在含有Piromyces XI的都會增加木糖的消耗。故木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖和PPP活性進有所提高，這對于木酮糖代謝是必須的對釀酒酵母中木酮糖利用也是必須的。故含有非氧化PPP途徑可作為促進木糖代謝的起始途徑。我們利用微點陣分析法和代謝流量統(tǒng)計對該系統(tǒng)進行了分析。非氧化PPP酶的最優(yōu)條件還需進一步研究。

4.5 其它代謝過程

磷酸乙酮醇酶途徑即將5-磷酸-D木酮糖轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸鹽已在細菌和紅酵母菌系得到探測［35］。對于來自乳酸雙歧桿菌的磷酸酮醇酶在利用木糖的釀酒酵母中進行異源表達會減少木糖醇產(chǎn)量［36］，增加磷酸鹽累積降低木糖消耗，缺失編碼NADPH—依賴型ALD6，會增加乙醇產(chǎn)量和提高木糖發(fā)酵效率。在釀酒酵母中有碳產(chǎn)物抑制，即與其它糖相比首先利用葡萄糖，

5 結(jié)論和前景展望

本文研究發(fā)現(xiàn)木糖醇脫氫酶（XDH）的相對含量比木糖還原酶（XR）高就可以增加乙醇含量，降低木糖醇的產(chǎn)量；ScXK基因的過表達會增加乙醇產(chǎn)量，同時大大降低釀酒酵母中的木糖的消耗，通過表達突變基因減少NADPH，PsXDH和ScXK的親和性也可達到上述目的。

促進木糖發(fā)酵的新研究點主要有轉(zhuǎn)錄子，蛋白質(zhì)組，代謝組和磁通量子這些均可增強木糖產(chǎn)乙醇速率。木糖發(fā)酵的蛋白質(zhì)組分析已經(jīng)揭露了22種蛋白（如Adh2p、Ald4p、和Ald6p）顯示出比葡萄糖高的發(fā)酵水平。隨著能源價格持續(xù)上漲和因溫室氣體過量排放而導(dǎo)致的全球變暖趨勢的愈演愈烈，利用木質(zhì)纖維素材料生產(chǎn)燃料乙醇已成為世界各國研究的熱點。相信隨著研究的深入，必將有性能更優(yōu)良的木糖代謝工程菌應(yīng)用于燃料乙醇的生產(chǎn)。

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