彭文嵐 劉文娜 高靜

（青島科技大學化工學院，山東 青島 266042）

目前的癌癥治療方法主要存在兩個缺陷：不能有效地定位于目標腫瘤和不能有效地穿透腫瘤組織。定位性差限制了標準療法的給藥量，穿透性差使得進入腫瘤組織中的藥量減少。這兩個缺點導致目前的治療方法不能根除所有的腫瘤細胞，從而導致癌癥復發(fā)［1］。另外，在化學療法兩個療程間隔的時間內(nèi)，個別癌細胞會內(nèi)滲進入血管組織而增加轉(zhuǎn)移的風險。癌癥復發(fā)和并發(fā)癥是目前癌癥病人死亡的主要原因。因此，要想完全治愈癌癥就必須克服這兩個缺點。細菌能夠?qū)Ｒ恍缘貎?yōu)先累積在腫瘤的低氧和壞死區(qū)域，經(jīng)基因工程改造后可成為癌癥治療的有效工具。

有效的細菌療法需要具有能準確定位于腫瘤組織，從遺傳上入手，無毒性，瘤內(nèi)定位和有效輸送抗癌藥物等特點［2］。在小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)有多種細菌如梭菌屬（Clostridium），沙門氏菌屬（Salmonella），雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和埃希桿菌屬（Escherichia）［5］能特定的在腫瘤組織中積累。對于毒性和遺傳可操作性，也已經(jīng)做了大量的研究。目前的研究主要關注的是最后兩項：有效的瘤內(nèi)定位和藥物輸送。另外要做的研究還包括將細菌與治療載體和抗癌物質(zhì)相結合。一旦解決了這些問題，癌癥"細菌療法"將取得突破性的進展。

1 基因修飾和毒性

為了使細菌成為有效的抗癌載體，在過去的10年里進行了大量關于細菌毒性消除和基因修飾的研究。要使細菌滿足治療要求，必須對它進行基因修飾。在已研究過的三種細菌中，大腸桿菌是基因工程的模式生物，可以進行各種程度的基因修飾，沙門氏菌也具有同樣的能力。但梭狀芽胞桿菌屬的使用有一些難度，因為利用傳統(tǒng)的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化和電轉(zhuǎn)化方法很難使其發(fā)生改變，需要研究一種新技術以拓寬梭狀芽胞桿菌屬基因修飾的寬度［6］。

因為許多細菌本身就有致病性所以必須除去細菌毒性。1947年，有報道將溶組織梭菌（Clostridium histolyticus）的芽胞直接注入小鼠移植性肉瘤內(nèi)，發(fā)現(xiàn)能使腫瘤液化消退，但由于梭菌本身的毒性以及由其介導的溶瘤作用能引起急性毒性反應甚至死亡，最后只有極少數(shù)動物存活下來［7］。后來通過熱處理除去其致病基因獲得一株諾維氏梭菌（Clostridium novyi）的無毒菌株，能廣泛定植于腫瘤壞死區(qū)域而不損壞正常組織。缺失msbB-和purI-基因的鼠傷寒沙門氏菌突變體在臨床試驗中證明無毒性［8］，已經(jīng)廣泛用于癌癥研究。也已證明大腸桿菌的減毒型突變體E.coli Nissle 1917無致病性，可用來治療癌癥。

2 瘤內(nèi)定位

化學療法存在的主要問題是不能滲透所有腫瘤微環(huán)境，且目前的療法都不能精確的定位在那些存在藥物抵抗力的腫瘤區(qū)域上，而細菌可以很好的解決這一問題。細菌瘤內(nèi)定位的三種機理是特殊趨化性、優(yōu)先生長和厭氧生長。兼性厭氧菌如沙門氏菌和埃希氏菌主要利用特殊趨化性和優(yōu)先生長，專性厭氧菌如梭狀芽胞桿菌和雙岐桿菌屬主要利用厭氧生長來實現(xiàn)其定位目的。這些機制使得細菌既可以定位于特定的腫瘤區(qū)域，又不會傷害正常組織。

正常組織和腫瘤組織的細胞微環(huán)境和血管結構有很大的不同。在腫瘤組織中由于血流量紊亂造成微環(huán)境異常，導致細胞生長速率和藥物濃度梯度改變，出現(xiàn)厭氧和酸性區(qū)域［9］。腫瘤這種獨特的細胞微環(huán)境有利于細菌生長，這是細菌具有特殊定位能力的主要原因。

藥物濃度梯度的存在導致某些癌細胞中的藥物水平不能達到有效清除濃度［10］。為了克服這種局限性，需要一種有效的藥物輸送方法。大多數(shù)治療法依靠被動擴散來輸送藥物，這些方法的腫瘤特異性較高，但是因為擴散局限性而不能滲透到腫瘤組織內(nèi)部。鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）是一種兼性厭氧菌，它可以受腫瘤中不同的微環(huán)境吸引，具有主動運輸能力，從而克服擴散局限性滲透到腫瘤抗性區(qū)域，這種能力使得細菌成為一個吸引人的體系。就目前所知，具有運動能力的細菌是唯一能主動運輸也是唯一能有效注入所有腫瘤組織的治療載體。小鼠模型實驗顯示鼠傷寒沙門氏菌優(yōu)先被腫瘤抗性區(qū)域中瀕死的癌細胞吸引［11］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，天冬氨酸受體控制細菌向腫瘤移動，絲氨酸受體引導細菌在腫瘤內(nèi)部的滲透，核糖/半乳糖受體引導沙門氏菌進入壞死區(qū)域。剔除核糖/半乳糖受體基因能使鼠傷寒沙門氏菌在腫瘤抗性區(qū)域積累，引起癌細胞死亡。這些發(fā)現(xiàn)表明通過控制特殊化學受體的表達，沙門氏菌可定位于任何腫瘤區(qū)域。

兼性厭氧菌定位于腫瘤組織利用的另外一個機理是優(yōu)先生長。在小鼠模型中，野生型鼠傷寒沙門氏菌優(yōu)先在壞死組織中生長。通過改造細菌使其成為不能在無營養(yǎng)素的微環(huán)境中存活的營養(yǎng)缺陷型菌可以控制其定位作用。由靜脈注入后，營養(yǎng)缺陷體向含有高濃度營養(yǎng)素的腫瘤區(qū)域移動并優(yōu)先增殖，但它不能在正常組織中生長。如鼠傷寒沙門氏菌的亮氨酸/精氨酸突變體能特異的在小鼠前列腺腫瘤中積累［12，13］。

研究發(fā)現(xiàn)沙門氏菌也可定位于含氧量較高的腫瘤區(qū)域和轉(zhuǎn)移灶。鼠傷寒沙門氏菌的好氧菌株在小鼠皮下腫瘤優(yōu)先積累，積累量是在肝和脾中的2000倍。除趨化性和優(yōu)先生長外，兼性厭氧菌在腫瘤抗性區(qū)域積累的原因還包括由巨噬細胞和嗜中性粒細胞引起的有限的免疫清除［15］。在早期腫瘤中，豬霍亂沙門氏菌（Salmonella choleraesuis）可在肺部轉(zhuǎn)移灶積累而不能在健康的周邊主質(zhì)組織中積累［16］。在常位腫瘤中，當用氯氨鉑給藥時，該菌株可以提高嗜中性粒細胞和T細胞的浸潤作用，具有明顯的抗腫瘤效果［17］。最近的研究顯示，大腸桿菌也可以在腫瘤中積累［18］，且在肝和脾中的積累水平要比腫瘤中低得多。將E.coli K-12注射到小鼠體內(nèi)后，會迅速引發(fā)抗癌免疫反應，從而大大減少肺部轉(zhuǎn)移灶的產(chǎn)生。

最易理解的細菌腫瘤定位機制是厭氧生長。當將細菌芽孢由靜脈注入后，專性厭氧菌選擇性的在含氧量低的腫瘤區(qū)域增殖。作為抗癌媒介研究最多的專性厭氧菌是梭狀芽胞桿菌。20世紀60年代多個研究證明梭狀芽胞桿菌可在小鼠和人類腫瘤壞死區(qū)域積累。將梭狀芽胞桿菌novyi NT芽孢與化學療法和抗血管因子聯(lián)合使用，可有效定位于小鼠的無血管、壞死的腫瘤區(qū)域，減少腫瘤復發(fā)。將梭狀芽胞桿菌novyi NT與放射療法聯(lián)合使用，可提高治療效果。梭狀芽胞桿菌novyi NT的完整基因組序列顯示其芽孢含有可翻譯成氧化還原蛋白質(zhì)和脂肪酶的mRNA，所以它可以在腫瘤中存活和增殖［19］。非致病性的Clostridium acetobutylicm芽孢經(jīng)血管定位劑考布他汀A-4磷酸鹽實驗發(fā)現(xiàn)細菌在腫瘤中的生長有明顯改善。

兼性和專性厭氧菌的定位機制是互補的。專性厭氧菌對腫瘤有選擇性，因為低氧環(huán)境只在腫瘤中存在。這種高度專一性使得它們易于進入大型原發(fā)性腫瘤。相反，因為兼性厭氧菌依靠趨化性和優(yōu)先生長定位于腫瘤，所以它們能夠定位于轉(zhuǎn)移灶和腫瘤壞死區(qū)域。這種不同的定位機制使得醫(yī)生可以根據(jù)每個病人腫瘤的特點來決定治療方法。

3 可控的給藥途徑

細菌能夠合成和分泌蛋白質(zhì)，從而輔助其定位功能提供特殊和集中性的治療。利用蛋白質(zhì)的不同功能，可以設計三種細菌治療的方法：控制細胞毒性，酶類藥物激活和活性分子分泌。利用細菌定位性，這三種方法可對給藥時間和位置進行精密的控制，從而得到最佳治療效果，并將系統(tǒng)毒性降低到最小。一旦細菌定位在腫瘤環(huán)境中，它們就可以被激活產(chǎn)生能直接或間接治療疾病的化合物。

治療因素尤其是細胞毒性化合物的時序控制是必須的，因為在輸送至腫瘤的過程中基因表達的產(chǎn)物會擴散至全身，毒害健康組織。利用無毒因子如射線或小分子誘導的基因啟動子來控制表達可以克服這個問題。射線照射可以有效啟動基因表達，因為射線易于穿透人體組織進入腫瘤內(nèi)部特定位點。放射療法也是最常用的癌癥治療方法，這一方法已經(jīng)經(jīng)過體外實驗證實。在輻射誘發(fā)的recA啟動子序列時序控制下，梭狀芽孢桿菌的某一經(jīng)基因修飾的菌株Clostridium可表達TNFα。與未經(jīng)射線照射的對照組相比，其TNFα的表達量提高了44％。該研究還發(fā)現(xiàn)在recA之下的基礎基因表達很重要，會影響這種方法的可控性，通過向啟動子序列中插入放射敏感性基因可以很好的解決這一問題。其他元素的添加能使基礎產(chǎn)物的水平降低30％。而將這些啟動子與其他不同基因相結合，會獲得可控性更高的癌癥治療方法。

促進基因表達的另外一種方式是由小分子激活啟動子。L-阿拉伯糖對哺乳動物細胞和組織無害，已用于激活大腸桿菌PBAD啟動子。在細胞生長培養(yǎng)基中加入0.02％的L-阿拉伯糖，lux操縱子的表達量提高了105倍，但這一方法面臨的問題是小分子可能因為擴散局限性而無法到達細菌菌落。然而，在以前的試驗中并沒有發(fā)現(xiàn)這個問題，將小分子由靜脈注射15～30min后即可在腫瘤中檢測到。

控制給藥途徑的第二個機理是對細菌進行基因改造使其產(chǎn)生酶類，將無毒的藥物前體轉(zhuǎn)化為活性因子。沙門氏菌和梭狀芽孢桿菌已經(jīng)被設計用來表達胞嘧啶脫氨酶（CDase），從而將前體藥物中的5-氟胞嘧啶（5-FC）與化學療法的5-氟尿嘧啶（5-FU）分開。CDase能催化5-FC脫氨基轉(zhuǎn)變?yōu)?-FU，5-FU被代謝為5-FUTP和5-FdUTP，前者能整合入RNA代替UTP，從而抑制tRNA和mRNA的合成，后者則可抑制胸苷酸合成酶，導致DNA合成障礙，它可從RNA和DNA分子水平來干擾細胞的存活，并且該底物能通過細胞間的縫隙連接進行擴散，引起臨近細胞死亡（即旁觀者效應）［20］。在臨床試驗中，注射過該重組沙門氏菌的病人瘤內(nèi)5-氟尿嘧啶的水平比血漿中提高了300％。梭狀芽孢桿菌的某些種屬經(jīng)改造后可表達硝基還原酶，將CB1954（5-乙烯亞氨基-2，4-二硝基苯）轉(zhuǎn)化為它的4-羥胺衍生物，而后者的毒性要比前者高10000倍。體外實驗證明將藥物前體與細菌治療結合可促進腫瘤退化。這一研究還表明通過重復增量也可以獲得腫瘤的連續(xù)退化。

細菌可以產(chǎn)生生理活性分子誘導生理反應，這是其藥物輸送的第三個機理。研究發(fā)現(xiàn)梭狀芽胞桿菌經(jīng)改造后可以產(chǎn)生治療水平的白細胞介素-2［21］，從而引起T細胞介導的腫瘤死亡。低氧誘導因子-1α是一種轉(zhuǎn)錄因子，可以促進有利于細胞在低氧環(huán)境中生存的基因表達。目前已可用梭狀芽胞桿菌表達抗低氧誘導因子-1α的抗體片段，當它與定位因子聯(lián)合使用時，可以有效治療癌癥［22］。細菌也可用于輸送DNA［23-24］，在這個過程中，基因從細菌傳遞到癌細胞然后表達哺乳動物的治療蛋白。已設計出含有內(nèi)皮他丁和凝血酶敏感素-1基因的沙門氏菌。這兩個基因的產(chǎn)物通過抑制血管發(fā)生而阻礙腫瘤生長。在小鼠模型中，這兩種治療方法都能夠大大降低腫瘤生長速度。

盡管實驗證明細菌療法具有很大的優(yōu)越性，但是也存在許多的問題，比如在臨床上這些細菌不能很好地定植人的腫瘤，外源基因在腫瘤內(nèi)表達量不夠或者非靶向表達等。這些問題都需要進一步的研究來解決。

4 總結與展望

癌癥難治療是因為脈管系統(tǒng)較弱而限制了它對氧、營養(yǎng)素和藥物的輸送。細菌療法的優(yōu)勢是可以利用優(yōu)先生長和能動的分子運輸將藥物分子定位于瘤內(nèi)微環(huán)境。細菌抗癌研究的關鍵點是改造菌株，主要研究的兩個方向則是瘤內(nèi)定位和可控的給藥途徑。先前梭狀芽胞桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌的研究已證明某些細胞毒素、藥物前體活化酶和生物活性分子的表達可以被控制。定位和輸送系統(tǒng)的強度是互補的，當將兩者結合時，可使藥物到達所有的腫瘤和轉(zhuǎn)移灶區(qū)域，并有效的殺死所有的癌細胞。將幾種表達不同藥物的細菌聯(lián)合使用，有可能大大提高治療的可控性和有效性。隨著技術的進步，細菌療法有望成為對抗人類腫瘤的強大工具，為癌癥病人帶來福音。

［1］Davis A J，Tannock I F.Tumor physiology and resistance to chemotherapy：repopulation and drug penetration［J］.Cancer Treat Res，2002，112：1-26.

［2］Forbes N S.Profile of a bacterial tumor killer［J］.Nat Biotechnol，2006，24：1484-1485.

［3］Yu Y A，Shabahang S，Timiryasova T M，et al.

［4］Purdy D，O’Keeffe T A，Elmore M，et al.Conjugative transfer of clostridial shuttle vectors from Escherichia coli to Clostridium difficile through circumvention of the restriction barrier［J］.Mol Microbiol，2002，46：439-452.

［5］馮春燕，郭曉奎.細菌作為抗腫瘤載體的研究進展［J］.中國微生態(tài)學雜志，2006，18（5）：414-415.

［6］Nemunaitis J，Cunningham C，Senzer N，et al.Pilot trial of geneticallymodified，attenuated Salmonella expressing the E.coli cytosine deaminase gene in refractory cancer patients［J］.Cancer Gene Ther，2003，10：737-744.

［7］Tredan O，Galmarini C M，Patel K，et al.Drug resistance and the solid tumor microenvironment［J］.Natl Cancer Inst，2007，99：1441-1454.

［8］Minchinton A I，Tannock I F.Drug penetration in solid tumours［J］.Nat Rev Cancer，2006，6：583-592.

［9］Kasinskas R W，F(xiàn)orbes N S.Salmonella typhimuriumspecifically chemotax and proliferate in heterogeneous tumor tissue in vitro［J］.Biotechnol Bioeng，2006，94：710-721.

［10］Zhao M，Yang M，Li X M，et al.Tumor-targeting bacterial therapy with amino acid auxotrophs of GFP-expressing Salmonella typhimurium［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102：755-760.

［11］Zhao M，Yang M，Ma H，et al.Targeted therapy with a Salmonella typhimurium leucine-arginine auxotroph cures orthotopic human breast tumors in nude mice［J］.Cancer Res，2006，66：7647-7652.

［12］WestphalK，LeschnerS，Jablonska J，etal.Containment of tumor-colonizing bacteria by host neutrophils［J］.Cancer Res，2008，68：2952-2960.

［13］Lee C H，Wu C L，Shiau A L.Systemic administration of attenuated Salmonella choleraesuis carrying thrombospondin-1 gene leads to tumor-specific transgene expression，delayed tumor growth and prolonged survival in themurinemelanomamodel［J］.Cancer Gene Ther，2005，12：175-184.

［14］Lee C H，Wu C L，Tai Y S，et al.Systemic administration of attenuated Salmonella choleraesuis in combination with cisplatin for cancer therapy［J］.Mol Ther，2005，11：707-716.

［15］Weibel S，Stritzker J，Eck M，et al.Colonization of experimental murine breast tumours by Escherichia coli K-12 significantly altersthe tumourmicroenvironment［J］.Cell Microbiol，2008，10（6）：1235-1248.

［16］Bettegowda C，Huang X，Lin J，et al.The genome and transcriptomes of the anti-tumor agent Clostridiumnovyi-NT［J］.Nat Biotech，2006，24：1573-1580.

［17］安麗萍，周明，傅桂蓮，等.活菌作為抗腫瘤制劑和腫瘤基因治療載體的研究［J］.北華大學學報（自然科學版），2003，4（5）：386-389.

［18］Barbe S，Van Mellaert L，Theys J，et al.Secretory production of biologically active ratinterleukin-2 by Clostridium acetobutylicum DSM792 as a tool for anti-tumor treatment［J］.FEMS Microbiol Lett，2005，246：67-73.

［19］Groot A J，Mengesha A，van der Wall E，et al.Functionalantibodiesproduced by oncolytic clostridia［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，364：985-989.

［20］Palffy R，Gardlik R，Hodosy J，et al.Bacteria in gene therapy：bactofection versus alternative gene therapy［J］.Gene Ther，2006，13：101-105.

［21］Vassaux G，Nitcheu J，Jezzard S，et al.Bacterial gene therapy strategies［J］.Pathol，2006，208：290-298.