崔可賾,張明磊

(1.海口市人民醫(yī)院 骨科,海南 海口 570208;2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 骨科,吉林 長春 130021）

當細胞植入體內(nèi)后,必須盡快發(fā)生血管化,建立血液循環(huán),通過血液-細胞間液使細胞獲得營養(yǎng)及氧氣,維持其活力,進而發(fā)揮成骨作用,修復骨缺損。充分的血液供應是保證細胞在體內(nèi)存活的決定性因素。在應用大塊組織工程骨修復骨缺損時,其核心部位往往發(fā)生缺血性壞死,其原因是不能實現(xiàn)早期的血管化,導致支架中心的細胞因無法進行正常的新陳代謝而大量死亡[1]。有研究表明,植入體內(nèi)后,遠離毛細血管200 μ m以上的細胞將因為得不到營養(yǎng)和氧氣而死亡,限制了在臨床上的應用[2]。血管化已經(jīng)成為骨組織工程的關鍵技術,能夠?qū)⒀鯕饧盃I養(yǎng)物質(zhì)攜帶到局部微環(huán)境中,帶走新陳代謝產(chǎn)生的廢物及壞死分解產(chǎn)物,以維持一個動態(tài)的局部微環(huán)境。

1 材料和方法

1.1 材料pEGFP-N1/VEGF真核表達質(zhì)粒,LIPofectamineTM脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(Gibco公司）,DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司）,胎牛血清(美國Hyclone公司）,SP免疫組化試劑盒、DAB,兔抗人VEGF抗體(Santa Cruz）。

1.2 方法

1.2.1 細胞的轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前一天,采用胰酶消化法將處于對數(shù)生長期的細胞制備成單個細胞液,計數(shù)后調(diào)整細胞濃度為2×105細胞/ml,接種于6孔板,每孔2 ml。次日細胞融合鋪滿板底80%左右時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染采用LIPofect-amineTM試劑盒進行。

1.2.2 轉(zhuǎn)染后的觀察及計算轉(zhuǎn)染率 細胞轉(zhuǎn)染48小時,光鏡和熒光顯微鏡下觀察細胞轉(zhuǎn)染后熒光表達情況。

轉(zhuǎn)染效率計算:10個視野轉(zhuǎn)染陽性細胞數(shù)之和/細胞總數(shù)之和=該孔細胞轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 ELISA方法檢測BMP-2的表達 分別于1 d、4 d、7 d、10 d 、15 d、21 d 采用 ELISA 方法檢測轉(zhuǎn)染了各組質(zhì)粒的BMSCs培養(yǎng)液中VEGF蛋白的表達。

1.2.4 免疫組織化學染色 細胞以1×105/mL、2 mL/孔,接種于鋪有經(jīng)多聚賴氨酸處理過的蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24 h。PBS輕洗3次,4%的多聚甲醛4℃固定,血清封閉,室溫孵育10 min。傾去血清,滴加抗體,滴加 50 μ l生物素標記的1∶100稀釋的二抗,37℃孵育30 min,PBS沖洗,滴加50 μ l新配置的DAB顯色劑溶液,顯色后,自來水沖洗,蘇木素復染。梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡下觀察

熒光顯微鏡下觀察,pEGFP-Nl/VEGF轉(zhuǎn)染組發(fā)出綠色熒光。通過計算,轉(zhuǎn)染率為40.1%,見圖1。

2.2 ELISA方法檢測VEGF

結(jié)果顯示正常BMSCs及VEGF轉(zhuǎn)染組均有目的蛋白的分泌,對兩組組間進行統(tǒng)計學分析,BMP-2轉(zhuǎn)染組與正常細胞有顯著性差別(P＜0.05）。

表1 各組平均VEGF(pg/ml）

2.3 免疫組化染色

顯微鏡下觀察,轉(zhuǎn)染組細胞中均可見深棕黃色染色。提示BMP-2基因轉(zhuǎn)染后在細胞中表達目的基因,并促進成骨方向轉(zhuǎn)化,見圖2。

2.4 RT-PCR結(jié)果

利用RT-PCR檢測細胞的mRNA表達,在相應分子量處出現(xiàn)條帶,說明目的基因在細胞中高表達。見圖3。

圖1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的熒光照片×200

圖2 VEGF免疫組化染色×200

圖3 RT-PCR結(jié)果

3 討論

血管再生的形態(tài)發(fā)生過程有幾個基本步驟[3]:(1）血管的舒張,相鄰細胞間的接觸減少,生長因子的作用下EC被激活;(2）EC增殖;(3）大量蛋白溶解酶分泌激活,降解血管基底膜,形成新血管的芽突;(4）形成細胞外基質(zhì),血漿和血漿蛋白從血管中外滲,其中含有的纖維素和纖維粘連蛋白形成膠樣物質(zhì),沉積在細胞外間質(zhì)內(nèi),對血管內(nèi)皮細胞起到支架作用;(5）EC形成血管樣結(jié)構(gòu)(6）血管的成熟和改建,新生血管在蛋白酶的作用下,管壁逐漸增厚,彈性增加;(7）平滑肌細胞、成纖維細胞等參與使血管定型。血管內(nèi)皮細胞在血管再生的過程中起到重要的作用,因此,血管化的關鍵環(huán)節(jié)是內(nèi)皮細胞的增殖、分化、遷移和聚集。

VEGF是一種糖蛋白,具有特異性促血管內(nèi)皮細胞生長和血管生成誘導作用的因子[4],在骨愈合過程中具有重要作用,其與血管內(nèi)皮細胞表面的特異性受體結(jié)合,一方面可以促進內(nèi)皮細胞增殖、遷移;另一方面增加局部毛細血管通透性,使纖維蛋白原滲出,于周邊形成凝膠樣基質(zhì),可支持并誘導毛細血管長入[5]。

VEGF作為旁分泌因子參與骨的形成與代謝[6],并在骨折的修復、塑型和改造過程中發(fā)揮作用,對骨形成及修復起到正性調(diào)節(jié)作用[7]。Spector[8]發(fā)現(xiàn)VEGF能引發(fā)成骨細胞的遷移及分化,且引起成骨細胞遷移及分化所需的濃度比BMP-2還低100倍。VEGF對原始成骨細胞有趨化遷移作用,對骨的形成和重建有功能性的作用[9]。

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