李平法， 李生瑩， 閆福林， 牛秉軒， 詹合琴

神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3(Neurotrophin-3，NT-3)是神經(jīng)生長(zhǎng)因子家族成員之一，其對(duì)感覺神經(jīng)元、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和交感神經(jīng)元的存活與功能有著十分重要的意義［1～3］。它能使受損的神經(jīng)元長(zhǎng)出側(cè)芽，促進(jìn)神經(jīng)損傷的修復(fù)，應(yīng)用NT-3可使3/4的脊髓萎縮細(xì)胞發(fā)生逆轉(zhuǎn)，使細(xì)胞的存活數(shù)量明顯增加［4］。

近期，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)NT-3與缺血性腦損傷關(guān)系密切，Zhang等將改良表達(dá)NT-3的神經(jīng)干細(xì)胞移植到嚴(yán)重局部腦缺血的大鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示存活的移植干細(xì)胞分泌高水平的 NT-3［5］，Benoit等人研究發(fā)現(xiàn)在腦缺血再灌注損傷期間，具有完整結(jié)構(gòu)的補(bǔ)體C1q可以誘導(dǎo)神經(jīng)元基因的表達(dá)，使NGF和NT-3表達(dá)增加，從而促進(jìn)缺血后神經(jīng)功能的恢復(fù)［6］。

本實(shí)驗(yàn)小組前期研究發(fā)現(xiàn)高翅果菊提取物L(fēng)ac-tuside B(LB)具有較好的抗腦缺血作用［7］，但其作用機(jī)制不明。本研究擬從該單體化合物對(duì)大鼠缺血性腦損傷海馬和紋狀體NT-3表達(dá)的影響入手，擬闡明Lactuside B抗缺血性腦損傷的部分作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、藥品及儀器 loading buffer和RT-PCR試劑盒(寶生物工程大連有限公司)，DEPC液、溴化乙錠(美國(guó)Sigma公司)，瓊脂糖(西班牙Biowest公司)，50×TAE緩沖液(廣州威佳科技有限公司)，D2000DNA分子量標(biāo)記物(北京天根生化有限公司)和 Trizol(美國(guó) Invertrogen公司)，無水乙醇、異丙醇和氯仿(天津市德恩化學(xué)試劑有限公司);AG PCR擴(kuò)增儀(德國(guó)Eppendorf公司)，DYY-7C型水平電泳儀(北京市六一儀器廠)，UV-2102PC紫外分光光度計(jì)(尤尼柯上海儀器有限公司)，TGL-16G-A臺(tái)式高速低溫離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，MDF-U4086S超低溫冰箱(日本 SANYO公司)，TOCAN240凝膠成像系統(tǒng)(上海領(lǐng)成生物科技有限公司);尼莫地平注射液(山東方明藥業(yè)股份有限公司)，水合氯醛粉劑(天津市瑞金特化學(xué)品有限公司);LB(由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥化教研室閆福林教授提供，為白色粉末狀，純度＞98%)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組與給藥 動(dòng)物采用健康清潔Ⅱ級(jí)雄性SD大鼠，體重280～320g，購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào):SYXK(豫)2005－0012。動(dòng)物隨機(jī)被分為:假手術(shù)組、模型組、陽性藥物對(duì)照組、LB低劑量組(12.5mg/kg)、中劑量組(25mg/kg)和高劑量組(50mg/kg)，共6組，8只/組。所有動(dòng)物于再灌后每天給藥1次，均按5ml/kg腹腔注射給藥。假手術(shù)組、模型組分別給予等體積的蒸餾水，陽性對(duì)照組給予尼莫地平(1mg/kg)，LB低、中、高劑量組分別給予相應(yīng)劑量的實(shí)驗(yàn)藥物。各組動(dòng)物于再灌注24h和72h后分別處死4只，進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程對(duì)動(dòng)物的處理符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。

1.3 大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞線的制備 1.5號(hào)日本漁線(DaDong Yang制造)，直徑 0.2mm，剪成5cm的數(shù)小段，將其末端靠近火焰燒圓，在長(zhǎng)2.0cm處做標(biāo)記，放入肝素鈉溶液中浸泡備用。

1.4 大鼠缺血性腦損傷模型的制備及模型成功判定指標(biāo) 大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷模型的制備參照Longa［8］線栓法和本組實(shí)驗(yàn)方法制備大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷模型(動(dòng)物麻醉采用10%的水合氯醛)，將預(yù)先制備好的阻塞線插入頸內(nèi)動(dòng)脈(intemal carotid artery，ICA)，插入長(zhǎng)度為2.0cm，假手術(shù)組阻塞線插入ICA長(zhǎng)度為0.5cm，將動(dòng)物傷口處縫合后回籠飼養(yǎng)。所有動(dòng)物均阻塞2h后再把阻塞線球端拉回頸外動(dòng)脈進(jìn)行再灌注，動(dòng)物在手術(shù)清醒后和處死前根據(jù)Zea-longa評(píng)分法［8］進(jìn)行神經(jīng)缺損癥狀評(píng)分。

1.5 RT-PCR方法檢測(cè)NT-3基因的轉(zhuǎn)錄水平取所需實(shí)驗(yàn)大鼠斷頭取腦，快速分離出雙側(cè)海馬和紋狀體(取殼核和尾狀核的全部條紋狀組織)在液氮中磨碎，Trizol抽提總RNA，檢測(cè)其純度和濃度保證所提的RNA無降解和污染。用TaKaRa pime-Script TM RT-PCR試劑盒合成cDNA模板，以β-actin基因作為內(nèi)參基因。PCR反應(yīng)溶液為50μl，上下游引物(見表1)各0.5μl(100μmol/L)。PCR 反應(yīng)條件為:95℃ 5min;95℃ 30s、50℃ 30s、72℃ 1min，30個(gè)循環(huán);72℃ 10min。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠成像分析儀拍照記錄后用Quantity One圖像分析軟件測(cè)定各條帶灰度，以擴(kuò)增的特異性目的片段灰度值與同時(shí)擴(kuò)增的內(nèi)參β-actin片段灰度值的比值作為特異性擴(kuò)增目的片段的半定量檢測(cè)值，每組每只實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，求其平均值。

2 結(jié)果

2.1 大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型成功的判定和LB對(duì)大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分的影響 手術(shù)動(dòng)物麻醉清醒后，假手術(shù)組大鼠活動(dòng)正常，無神經(jīng)功能缺損癥狀。模型組大鼠則出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)缺損表現(xiàn)，如左側(cè)前肢屈曲內(nèi)收、爬行時(shí)向左側(cè)劃圈、站立時(shí)向左側(cè)傾倒和意識(shí)喪失等，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分在1～4分之間。LB各劑量組在缺血再灌注24h和72h后，均可降低大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05或 P＜0.01)，其中劑量組作用較強(qiáng)，與陽性藥物對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.05或 P ＜0.01);用藥72h后 LB 低、中劑量組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分低于用藥24h，中劑量組有顯著性差異(P ＜0.05或 P ＜0.01)(見表2)。

2.2 LB對(duì)大鼠缺血性腦損傷海馬組織各時(shí)段NT-3 mRNA的影響 實(shí)驗(yàn)顯示:LB各劑量組均能增加海馬NT-3 mRNA的表達(dá)，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05或 P＜0.01)，其低、中劑量組作用較好優(yōu)于陽性對(duì)照藥(P＜0.05或 P＜0.01)，用藥72h較用藥24h的作用更強(qiáng)，兩者相比有顯著性差異(見表3、圖1)。

2.3 LB對(duì)缺血性腦損傷大鼠紋狀體各時(shí)段NT3 mRNA的影響 結(jié)果顯示:LB各劑量組均能增加紋狀體NT-3 mRNA的表達(dá)，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05或 P＜0.01)，其中、低劑量組優(yōu)于陽性對(duì)照藥(P＜0.05或 P＜0.01)，用藥72h較用藥24h的作用更強(qiáng)，兩者相比有顯著性差異(見表4、圖2)。

表1 NT-3和β-actin的上下游引物

表2 LB對(duì)缺血性腦損傷大鼠神經(jīng)缺損癥狀評(píng)分的影響±s)

表2 LB對(duì)缺血性腦損傷大鼠神經(jīng)缺損癥狀評(píng)分的影響±s)

與模型組比較*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與陽性藥物對(duì)照組比較#P ＜0.05，##P ＜0.01;與用藥24h比較 ΔP ＜0.05，ΔΔP ＜0.01

組別 藥物劑量(mg/kg)時(shí)間麻醉清醒后24h 72h假手術(shù)組模型組陽性對(duì)照組LB低劑量組LB中劑量組LB高劑量組－－112.525500.00 ±0.003.72 ±0.453.95 ±0.353.26 ±0.853.98 ±0.633.99 ±0.520.00 ±0.003.60 ±0.512.61 ±0.52*2.11 ±0.48＊＊2.00 ±0.51＊＊#2.41 ±0.49＊＊0.00 ±0.003.69 ±0.712.58 ±0.53*Δ 2.05 ±0.58＊＊1.40 ±0.67＊＊##Δ 2.35 ±0.92＊＊Δ

表3 LB對(duì)缺血性腦損傷大鼠海馬NT-3 mRNA表達(dá)的影響±s)

表3 LB對(duì)缺血性腦損傷大鼠海馬NT-3 mRNA表達(dá)的影響±s)

與模型組比較*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與陽性藥物對(duì)照組比較#P ＜0.05，##P ＜0.01;與用藥24h 比較 ΔP ＜0.05，ΔΔP ＜0.01

組別 藥物劑量(mg/kg)IR 24h IR 72h假手術(shù)組模型組陽性對(duì)照組LB低劑量組LB中劑量組LB高劑量組－－112.525500.17 ±0.050.24 ±0.010.37 ±0.02＊＊0.50 ±0.02＊＊##0.61 ±0.04＊＊##0.33 ±0.01＊＊#0.18 ±0.010.21 ±0.010.57 ±0.01＊＊0.83 ±0.05＊＊##ΔΔ 0.97 ±0.06＊＊##ΔΔ 0.45 ±0.01＊＊

表4 LB對(duì)缺血性腦損傷大鼠紋狀體NT-3 mRNA表達(dá)的影響

圖1 Lactuside B對(duì)缺血性腦損傷大鼠海馬NT－3 mRNA表達(dá)的影響(PCR電泳圖)

圖2 LB對(duì)缺血性腦損傷大鼠紋狀體NT－3 mRNA表達(dá)影響(PCR電泳圖)

3 討論

缺血性腦損傷是由于各種原因引起的腦部供血減少或中斷而導(dǎo)致的以神經(jīng)感覺和運(yùn)動(dòng)障礙為主的一類腦血管性疾病，臨床上多見于腦血栓形成或腦栓塞，其它如藥物中毒、心臟驟停等原因也可導(dǎo)致不同程度的腦缺血性損傷。

缺血性腦損傷有著復(fù)雜的病理生理過程，由于腦血流的急性中斷和隨后的再灌注發(fā)生，可導(dǎo)致不同腦區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞廣泛損傷。腦缺血后神經(jīng)損害主要發(fā)生在大腦皮質(zhì)和紋狀體［9，10］，海馬部位的神經(jīng)元也易受累［11，12］。

有研究認(rèn)為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3(NT-3)在保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、避免其損傷死亡的過程中起著一個(gè)重要的作用，缺血性腦損傷的危險(xiǎn)因素可下調(diào)其在腦部的表達(dá)［13］。也有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后海馬 NT-3維持一定水平在某時(shí)間范圍內(nèi)有利于腦缺血［14］。

雖然NT-3對(duì)于缺血性腦損傷的保護(hù)作用早已被人們所認(rèn)知，但許多研究證實(shí)腦缺血后皮質(zhì)、海馬部位的 NT-3表達(dá)減少［15，16］，此可能是腦組織對(duì)缺血損害的一種防御性反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦損傷24h和72h后模型組動(dòng)物的NT-3 mRNA在海馬和紋狀體卻表達(dá)增多，主要原因可能為本實(shí)驗(yàn)所采用的時(shí)間點(diǎn)與其它研究有較大的差別，以往NT-3在腦組織的基因或蛋白表達(dá)研究都是在腦缺血后十幾分鐘或幾小時(shí)之內(nèi)取材，而本實(shí)驗(yàn)依據(jù)給藥需要設(shè)置的時(shí)間點(diǎn)較長(zhǎng)。Yang等研究報(bào)道，用核酶保護(hù)和原位雜交法檢測(cè)短暫性腦缺血大鼠海馬神經(jīng)元時(shí)發(fā)現(xiàn)NT-3的表達(dá)趨勢(shì)是先下降后上升［17］，故本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其它研究結(jié)果并不背離。

本實(shí)驗(yàn)研究還發(fā)現(xiàn)，在缺血性腦損傷大鼠的海馬和紋狀體組織，Lactuside B各劑量組均能增加其NT-3 mRNA的表達(dá)，且中、低劑量組優(yōu)于陽性對(duì)照藥，用藥72h NT-3 mRNA表達(dá)更多。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:Lactuside B良好的抗腦缺血作用與其能夠上調(diào)、維持海馬和紋狀體NT-3 mRNA的表達(dá)有關(guān)，但兩部位NT-3 mRNA的表達(dá)與其蛋白的表達(dá)是否一致，尚需在以后的實(shí)驗(yàn)中去研究證實(shí)。

目前，對(duì)于缺血性腦損傷的有效治療除了在治療窗內(nèi)進(jìn)行溶栓外，其它的藥物治療主要傾向于神經(jīng)功能的保護(hù)，但能見諸于臨床并有確切作用的藥物很少。有關(guān)Lactuside B抗缺血性腦損傷的作用和作用機(jī)制的研究，將為其作為神經(jīng)功能保護(hù)的潛在新藥提供一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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