吳昌標 林 平 鄭文金

（1.福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福州 350119；

2.福建農(nóng)林大學(xué)，福州 350002；

3.福清市文華實業(yè)有限公司，福清 350303；

4.莆田市金日興生物科技有限公司，莆田 351100）

1 引言

雞球蟲?。ˋvian coccidiosis）是集約化養(yǎng)雞業(yè)多發(fā)、危害嚴重且防治困難的寄生蟲病之一，造成的經(jīng)濟損失十分巨大[1-2]。據(jù)統(tǒng)計，包括防治該病所花的藥費在內(nèi)，全球每年損失約80億美元[3]。在我國，每年花在球蟲病預(yù)防方面的費用達到10～20億元人民幣，成為現(xiàn)代化集約式家禽養(yǎng)殖業(yè)中最耗資的疾病。

傳統(tǒng)上，防治雞球蟲病主要采取飼料中添加化學(xué)藥物的方法，這些藥物可以阻斷球蟲生活史從而達到控制球蟲病的目的[4]。雖然持續(xù)化學(xué)藥物添加已被證明對集約化雞場防治球蟲病有很高的效果[5-6]，然而化學(xué)藥物在治療雞球蟲病的同時對動物機體有不同程度的副作用，且在動物機體內(nèi)有不同程度的殘留，危害人類健康、污染環(huán)境[7]。用疫苗控制球蟲病和藥物防治相比，不僅經(jīng)濟、有效，節(jié)省勞動力，生產(chǎn)性能好，而且可以最大限度滿足消費者對綠色食品的關(guān)注，已成為防治雞球蟲病較好的技術(shù)手段[4]。國內(nèi)外一些單位開展了雞球蟲病免疫預(yù)防研究，取得了一定的成效，如中國農(nóng)業(yè)大學(xué)、廣西大學(xué)和新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)等單位相繼通過雞球蟲早熟系等方法的選育獲得了免疫原性好、致病性低的球蟲蟲株，用于雞球蟲病的免疫預(yù)防，獲得了良好的效果[8-9]。

為了探索福建省莆田市雞球蟲病免疫預(yù)防的方法，選育本地的球蟲株，本課題組應(yīng)用球蟲單卵囊分離技術(shù)分離雞柔嫩艾美耳球蟲莆田株，在此基礎(chǔ)上傳代選育其早熟系，并對其生物學(xué)特性進行研究，為福建省莆田市雞球蟲病的免疫預(yù)防奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

1日齡愛拔益加（Arbor Acres，AA）肉雞，購自莆田溫氏家禽有限公司，飼養(yǎng)于嚴格消毒的無球蟲舍內(nèi)，自由采食和飲水。

1.2 試驗飼料

由莆田市金日興生物科技開發(fā)有限公司按本實驗小雞營養(yǎng)需要單獨配制，不添加任何抗生素和其他抗球蟲藥物。

1.3 試驗卵囊

1.3.1 卵囊收集

從福建省莆田市某雞場采集患有柔嫩艾美耳球蟲病的病死雞，刮取盲腸內(nèi)容物及黏膜，置于研缽內(nèi)研磨，加水?dāng)嚢?、過濾。將濾液以3 000 r/min離心沉淀10 min，棄上清液，沉淀物中加飽和鹽水，充分攪拌混勻后3 000 r/min離心漂浮10 min，取上層液，加入約10倍量水，充分混勻后3 000 r/min離心沉淀10 min，棄上清，沉淀中加入2.5%重鉻酸鉀溶液并移入平皿中，置26～27oC恒溫培養(yǎng)箱孢子化。孢子化期間，保持溶液深度不超過2 cm，每天用吸管反復(fù)吹打3～4次，至80%以上卵囊孢子化時為止。孢子化后的卵囊液置4oC冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 單卵囊分離

取冰箱中保存的孢子化卵囊懸液，2 000 r/min離心10 min，棄上清，以同樣的速度和時間離心3～4次，用生理鹽水洗去重鉻酸鉀，然后加飽和食鹽水漂浮，用牙簽沾取懸液，點在瓊脂塊上，在顯微鏡下觀察。確認1個瓊脂塊只有1個卵囊，而且卵囊中有8個子孢子時，將含單個卵囊瓊脂塊經(jīng)口喂給4日齡無球蟲雛雞。感染后5 d逐只查糞便，發(fā)現(xiàn)卵囊即為單卵囊后代，收集并孢子化。

用單卵囊繁殖的后代，接種無球蟲雛雞進行增殖，同時觀察在腸道寄生部位、病變特征。顯微鏡下觀察增殖后的卵囊形狀、顏色、大小等特征。用測微器隨機測量100個孢子化卵囊，孢子囊大小，計算卵囊形態(tài)指數(shù)。

1.3.3 蟲株純化增殖

將單卵囊分離技術(shù)分離純化得到的卵囊，經(jīng)口感染小雞20只，收集增殖的卵囊，在2.5%的重鉻酸鉀溶液培養(yǎng)至孢子化后，置40C冰箱中保存。

1.4 早熟株選育

1.4.1 親代蟲株確定

將分離、鑒定、增殖的純化卵囊確定為親代蟲株，用于早熟系的選育、繁殖力和致病力的研究。

1.4.2 繁殖力測定

親代蟲株卵囊每1個半月感染復(fù)壯1次。復(fù)壯后的親代卵囊與最近1代選出的早熟系（第6代）卵囊分別感染2周齡小雞10只，接種量為孢子化卵囊60個，感染96 h后，連續(xù)3 d分別收集、計數(shù)兩組小雞糞便排出的卵囊數(shù)量，計算方法按McMaster法[10]。

1.4.3 致病力檢測

試驗設(shè)復(fù)壯后的親代卵囊組、最近一代選出的早熟系（第6代）卵囊組及不感染對照組，感染劑量為5×104個/只。感染當(dāng)天早晨試驗用14日齡小雞逐只空腹稱重，淘汰弱雛及體質(zhì)量過大者，編號。然后根據(jù)體質(zhì)量離散度隨機分組，每組30只。感染后1周結(jié)束試驗，以各試驗組的臨床表現(xiàn)、平均增重、相對增重率、死亡率和病變計分等為致病力指標[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單卵囊分離結(jié)果

將用單卵囊分離獲得的20個單卵囊分別感染20只1日齡AA雞，其中7只感染成功，分別收集7只小雞糞便中的卵囊，并對他們的卵囊的形狀、大小進行初步觀察和測量后，選擇了其中5號小雞所排的卵囊為親代蟲株卵囊。

2.2 親代蟲株卵囊大小的測量結(jié)果

將從5號小雞中分離出的親代蟲株感染小雞，收集卵囊獲得一定數(shù)量的純化蟲株卵囊后，測量增殖得到的卵囊及其孢子化卵囊大小各100個，結(jié)果見表1。

表1 親代卵囊和孢子囊形態(tài)和大小

2.3 早熟系選育結(jié)果

本次選育實驗共傳代6次，結(jié)果見表2。從試驗結(jié)果來看，經(jīng)過6代的早熟選育，第六代蟲株的卵囊潛在期比親代的提前了6 h。

表2 早熟系繼代選育結(jié)果

2.4 繁殖力測定結(jié)果

分別用復(fù)壯后的親代蟲株與初選出來的早熟系（即第6代）卵囊感染小雞，測定二者的繁殖力，結(jié)果見表3。從實驗結(jié)果來看，經(jīng)過6代的早熟選育，早熟蟲株的繁殖力已明顯下降，僅為親代的50.6 %。

表3 繁殖力測定

表4 致病性檢測結(jié)果

2.5 致病性檢測結(jié)果

用5×104個/只劑量作感染實驗，早熟系和親代球蟲致病結(jié)果見表4。從表4可以看出，經(jīng)6代早熟選育的莆田球蟲株仍有一定的致病性，但與親代球蟲相比，二者在死亡率、相對增重率、平均增重和病變計分等指標方面均有較大差異，早熟系的致病性明顯減弱。

3 討論與結(jié)論

3.1 單卵囊分離技術(shù)

本研究應(yīng)用單卵囊分離技術(shù)從福建省莆田市球蟲病雞糞便排出的卵囊中，成功的分離出了純種雞球蟲蟲株，根據(jù)對其卵囊形態(tài)（卵囊形態(tài)指數(shù)1.16）、大?。?2.6×19.4）、寄生部位（盲腸）、親代潛在期（118 h）、卵囊孢子化時間（20 h）和病變特征的分析[11]，可以初步確定從福建省莆田市該雞場所分離的球蟲株為柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella）。

3.2 選育柔嫩艾美耳球蟲早熟系

柔嫩艾美耳球蟲莆田株經(jīng)6代的早熟選育，孢子化的卵囊有感染性，口服感染后在雞體內(nèi)繁殖，形成卵囊隨糞便排出體外，重復(fù)收集純化感染后最先排出的卵囊，獲得雞球蟲早熟株。早熟蟲株卵囊潛在期比親代蟲株提前了6h，獲得了具有早熟傾向的蟲株。

3.3 早熟系的繁殖力明顯下降

球蟲的繁殖包括無性繁殖和有性繁殖階段由于早熟株最后一代裂殖生殖缺陷，導(dǎo)致了其繁殖力的下降。早熟柔嫩艾美耳球蟲繁殖力只有親代的50.6%，明顯減弱。

3.4 早熟系的致病性顯著降低

綜合早熟柔嫩艾美耳球蟲和親代蟲株的臨床癥狀、死亡率、相對增重率、平均增重和病變計分的統(tǒng)計分析結(jié)果，早熟柔嫩艾美耳球蟲致病力減弱。這與國內(nèi)多個課題組研究結(jié)果一致[12-13]，由于早熟株最后一代裂殖生殖不完全，最后一代裂殖生殖快且內(nèi)含親本株較少的裂殖子，比親本提前進入配子生殖，裂殖生殖世代的減少，對腸道上皮細胞的破壞力下降而使其毒性顯著降低。

早熟性狀是由基因決定的，甚為穩(wěn)定，一般不存在毒力回復(fù)突變的可能[14]。本研究選育的柔嫩艾美耳球蟲早熟系穩(wěn)定性好，繁殖力下降、致病性減弱，可以進一步進行免疫原性的研究，以便用于雞的免疫，預(yù)防雞的球蟲病。

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