430061 湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院 樊云 甘水詠

430000 湖北省武漢市第十一醫(yī)院 吳淼

430014 湖北省中山醫(yī)院 何生華

中醫(yī)學(xué)陽虛證的主要內(nèi)在特征之一是機(jī)體免疫系統(tǒng)功能低下，外周血白細(xì)胞介素-2(interleukin-2，IL-2)水平是反映機(jī)體免疫系統(tǒng)功能狀況的重要指標(biāo)。大量臨床實(shí)踐顯示，推拿療法防治免疫系統(tǒng)功能低下類疾病具有良好的效果。但目前國(guó)內(nèi)對(duì)中醫(yī)藥防治免疫系統(tǒng)功能低下類疾病的實(shí)驗(yàn)研究多集中在針灸、中藥等方面，本研究嘗試從穴位推拿的角度來探討推拿療法防治陽虛證的免疫學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wister大鼠30只，6～7周齡，200～250 g[清潔級(jí)，湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，許可證號(hào)：SCXK(鄂)2003-0005]，雌雄兼用。

1.2 主要試劑 大鼠IL-2定量ELISA試劑盒由上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司提供；醋酸潑尼松注射液(AHP)：125 mg/5 mL，浙江仙琚制藥股份有限公司產(chǎn)品；黃芪注射液：20 g/10 mL，杭州正大青春寶藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；質(zhì)量濃度為0.009 g/mL的氯化鈉注射液，質(zhì)量濃度為0.05 g/mL的葡萄糖注射液等。

1.3 主要儀器設(shè)備 XD711C型全自動(dòng)酶標(biāo)儀 (編號(hào)：01710318，上海迅達(dá)醫(yī)療儀器公司)、北京醫(yī)用離心機(jī)廠LD5-2A型離心機(jī)、武漢市自動(dòng)儀表廠TCS-200A型電子秤(量制鄂字01000127)、試管震蕩器、電熱恒溫水箱、自制小型電動(dòng)按摩治療儀等。

1.4 實(shí)驗(yàn)過程

1.4.1 陽虛大鼠動(dòng)物模型的建立 Wister大鼠每天每鼠按照3 mg/100 g體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行大腿肌肉注射AHP，連續(xù)5 d。大鼠出現(xiàn)拱背、蜷曲、肢尾冷、擠臥在一起、神疲、反應(yīng)遲鈍、被毛疏松、失去光澤、消瘦、少食、腰膝酸軟(游泳存活時(shí)間縮短)、畏寒肢冷、精神不振、脫毛虛損狀[1]。根據(jù)中醫(yī)陽虛證辨證參考標(biāo)準(zhǔn)[2]，類似“陽虛”狀態(tài)。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將建立好的陽虛模型大鼠編號(hào)，根據(jù)隨機(jī)分組表，分為生理鹽水灌服對(duì)照組(A組)、黃芪注射液注射組(B組)、穴位推拿治療組(C組)，共3組，每組10只，雌雄分養(yǎng)。

1.4.3 實(shí)驗(yàn)方法 A組大鼠每天每鼠用注射器灌服生理鹽水3 mL，1次/d，連續(xù)2周；B組大鼠每天每鼠按照1 g/100 g體質(zhì)量在大腿肌肉注射黃芪注射液，1次/d，連續(xù)2周；C組大鼠每天每鼠用自制小型電動(dòng)按摩治療儀在其足三里、腎俞兩穴進(jìn)行定量推拿，2次/d，每次每穴10 min，連續(xù)2周。經(jīng)過測(cè)量，自制小型電動(dòng)按摩治療儀撞頭叩擊穴位的頻率為240次/min，相當(dāng)于推拿手法中的振動(dòng)類手法，叩擊穴位的力度為250 N/次。選穴：“足(后)三里”穴(雙)，定位于后肢脛骨粗隆外膝至踝間上1/5處[3]；“腎俞”穴，定位，首先用手觸摸到大鼠背部脊柱及兩旁的肋骨，在肋骨結(jié)束的水平，定位第十二胸椎，然后往下數(shù)二個(gè)棘突，左右旁開10 mm(同身寸，大約為人體的1/10)即為“腎俞”穴[4]。

1.4.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè) ①采用大鼠眼球摘除取血法取被檢測(cè)大鼠新鮮全血2～3 mL，加入一次性EP管中。然后，各管中均加入50 μL 1%肝素鈉作為抗凝劑，立即用力搖晃EP管，以充分抗凝。②各EP管上離心機(jī)低速(500×g)離心5 min，取上清液備用。③取試劑盒中的20×洗滌液，用蒸餾水1∶20稀釋備用。④底物工作液配制：將大鼠IL-2定量ELISA試劑盒中的酶底物OPD片放入底物稀釋液中溶解，每片加液5 mL。⑤標(biāo)準(zhǔn)品液配制：使用前每管加入蒸餾水100 μL溶解后即可。⑥將大鼠IL-2定量ELA試劑盒中的96孔微孔板取8孔作為標(biāo)準(zhǔn)孔，每孔中各加入樣品稀釋液100 μL，第1孔加標(biāo)準(zhǔn)品100 μL，混勻后用加樣器吸出100 μL，移至第2孔。如此反復(fù)對(duì)倍稀釋至第7孔，最后，從第7孔中吸出100 μL棄去，使之體積均為100 μL。第8孔為空白對(duì)照。⑦加樣：在96孔板中取30孔作為待測(cè)品孔，每孔中加入待測(cè)大鼠新鮮全血離心后上清液100 μL。⑧將8孔標(biāo)準(zhǔn)孔板與30孔待測(cè)品孔板一起放置在反應(yīng)板上，然后把反應(yīng)板放入電熱恒溫水箱中37℃水浴120 min。⑨洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，向?yàn)V紙上印干。⑩每孔中加入第一抗體工作液50 μL。⑾將反應(yīng)板放入電熱恒溫水箱中37℃水浴120 min。⑿洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，向?yàn)V紙上印干。⒀每孔中加入酶標(biāo)抗體工作液100 μL。⒁將反應(yīng)板放入電熱恒溫水箱中37℃水浴120 min。⒂洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，向?yàn)V紙上印干。⒃每孔加入底物工作液100 μL，置37℃暗處反應(yīng)5～10 min。⒄每孔加入1滴終止液混勻。⒅把8孔標(biāo)準(zhǔn)孔板與30孔待測(cè)品孔板放入XD711C型全自動(dòng)酶標(biāo)儀中，將儀器項(xiàng)目名稱調(diào)到IL-2，類型調(diào)到定量，測(cè)量方式調(diào)到終點(diǎn)法，波長(zhǎng)調(diào)到492 nm，震動(dòng)調(diào)到否，標(biāo)準(zhǔn)值調(diào)到1∶0.00，儀器即開始自動(dòng)檢測(cè)待測(cè)樣品IL-2的水平。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)處理(表1)

所有計(jì)量資料結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，運(yùn)用SPSS 11.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

表1 各組陽虛大鼠實(shí)驗(yàn)后外周血中IL-2水平(pmol/L)比較(±s)

表1 各組陽虛大鼠實(shí)驗(yàn)后外周血中IL-2水平(pmol/L)比較(±s)

分組 n 指標(biāo)讀數(shù)生理鹽水灌服對(duì)照組(A組) 10 0.101 3±0.008 58黃芪注射液注射組(B組) 10 0.112 4±0.004 16★穴位推拿治療組(C組) 10 0.113 4±0.004 70★▲

注：與A組比較，★P＜0.01，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與B組比較，▲P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

3 討論

祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為陽虛是由于陽氣偏衰、正氣不足、陰陽失調(diào)從而使機(jī)體呈現(xiàn)機(jī)能衰退、代謝活動(dòng)減弱、熱量不足的病理狀態(tài)[1]。本實(shí)驗(yàn)用免疫抑制劑AHP注射液造成的“陽虛”模型可見大鼠萎靡不振、毛色無光澤、弓背少動(dòng)、反應(yīng)遲鈍、腹瀉等現(xiàn)象，此模型與鄺氏等報(bào)道的一致[5]。研究顯示陽虛證與機(jī)體免疫功能低下有關(guān)，而IL-2水平是反映機(jī)體體液免疫功能狀況的重要指標(biāo)。

IL-2在很多疾病的研究中不僅可以作為判斷病情輕重和機(jī)體免疫狀態(tài)的一個(gè)指標(biāo)，也是目前國(guó)內(nèi)外研究最為活躍、最清楚、最為廣泛的一種細(xì)胞因子，它具有顯著的免疫增強(qiáng)作用，不僅自身可促進(jìn)T細(xì)胞增生分化和B細(xì)胞分泌抗體，增強(qiáng)NK細(xì)胞和CTL的殺傷力，還可與其他細(xì)胞因子如IFN-γ、TNF等一起發(fā)揮免疫功能[6]。從體液免疫角度看，IL-2在淋巴因子調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的分枝網(wǎng)絡(luò)中處于中心地位。因此，IL-2在機(jī)體的免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)中具有重要意義[7]。

陽虛證如何治療？陽虛學(xué)說[8]認(rèn)為治療陽虛證的原則當(dāng)用溫補(bǔ)法?！鹅`樞·經(jīng)脈篇》曰：“盛則瀉之，虛則補(bǔ)之。”《素問·陰陽應(yīng)象大論》曰：“形不足者，溫之以氣；精不足者，補(bǔ)之以味?！敝嗅t(yī)臨床中常用的“扶正固本，補(bǔ)中益氣”經(jīng)典代表藥物之一是黃芪。有研究[9-10]發(fā)現(xiàn)黃芪對(duì)IL-2有正向調(diào)節(jié)，促進(jìn)分泌等作用。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“陽虛”的病變機(jī)制一般多以脾腎陽虛為主。針灸學(xué)中足三里穴是氣血“百川歸?！敝ǎ亲汴柮魑附?jīng)的下合穴，有補(bǔ)益后天之要功。五臟之中的“腎”被稱為“先天之本”。腎藏元?dú)?，中醫(yī)理論的“正氣存內(nèi)，邪不可干”，氣在人體有抵御各種病邪的功能，這與現(xiàn)代免疫學(xué)認(rèn)為的免疫三大功能：防御、自穩(wěn)、監(jiān)視是相一致的?！端貑枴り庩枒?yīng)象大論》曰：“腎生骨髓”，髓系腎之精氣所化生，能滋養(yǎng)骨骼。腎俞穴為腎之背俞，是腎之精氣聚集之處，為補(bǔ)腎之要穴。故本實(shí)驗(yàn)選擇足三里、腎俞穴立論，并與黃芪進(jìn)行對(duì)照。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：陽虛模型大鼠經(jīng)過足三里、腎俞穴量化推拿治療后，與生理鹽水灌服組比較，外周血中細(xì)胞因子IL-2水平明顯上升(P＜0.01)；陽虛模型大鼠經(jīng)過黃芪注射液肌肉注射后，與生理鹽水灌服組比較，其外周血中細(xì)胞因子IL-2水平明顯上升(P＜0.01)；足三里、腎俞穴量化推拿治療法與黃芪注射液肌肉注射法在提高陽虛模型大鼠外周血細(xì)胞因子IL-2的水平方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。由此可見，推拿足三里、腎俞穴，可以提高陽虛大鼠外周血IL-2水平，增強(qiáng)陽虛大鼠免疫能力。

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