李曉燕 高天慧 李林蔚 劉明月

胃癌是我國最常見腫瘤之一，目前據(jù)Parkin報道其發(fā)生率位居第四位，死亡率僅次于肺癌占第二位［1］。手術是主要的治療措施，但由于早期診斷率低，大多數(shù)患者失去手術機會，胃癌的復發(fā)與轉移是胃癌治療失敗的主要原因之一［2］，因此化療在胃癌治療中處于非常重要的地位。有試驗研究表明:TopoIIα在胃癌組織中的高表達與胃癌的發(fā)生發(fā)展以及多種抗腫瘤藥物作用機制有關，并且與多藥耐藥有關。本研究應用免疫組織化學方法，檢測了胃癌中TopoIIα的表達，旨在探討其與胃癌的臨床病理特征的關系，指導胃癌化療及耐藥。

1 資料與方法

1.1 標本 收集河南省人民醫(yī)院病理科2008年10月至2010年10月間89例胃腺癌手術切除石蠟標本，取20例癌旁正常胃組織作為對照組，原發(fā)性胃癌的組織學分類標準參照2000年WHO胃癌組織學，均為胃腺癌，根椐2003年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)和2010美國腫瘤聯(lián)合會(AJCC)聯(lián)合制定的TNM分期標準進行臨床分期。

1.2 儀器與試劑 BP121S型分析天平、病理石蠟切片機、電熱恒溫培養(yǎng)箱、低溫冰箱、醫(yī)用燒烤微波爐、自動染片機、自動脫水機、微量吸管、光學顯微鏡、鏡下圖像以Olympus Dp70圖像采集分析儀進行采集、分析。

TopoIIα(產品編號:MAB-0588)，試劑盒選用即用型MaxVision檢測試劑盒，對二甲氨基偶氮苯(DAB)顯色劑，均購自福州邁新生物技術開發(fā)公司。酒精、二甲苯、蘇木素等試劑由河南省人民醫(yī)院病理科提供。

1.3 試驗方法 ①常規(guī)石蠟標本切片:使用切片機將本研究中所有石蠟包埋標本進行切片，所有切片厚度為3～5 μm;②標本脫蠟至水:脫蠟前標本置于60℃恒溫箱20 min。在二甲苯及梯度乙醇中脫蠟水化(二甲苯10 min×2次，無水酒精5 min×2次、90%酒精5 min×1次、75%酒精5 min×1次);③TopoIIα采用檸檬酸高溫修復，37℃水浴箱內孵育30 min;④PBS液沖洗3 min;⑤阻斷內源性過氧化物酶活性:H2O2100 ml+CH3OH 900 ml液避光室溫浸泡10 min，以消除內源性過氧化物酶的活性，然后蒸餾水沖洗2 min×1次，PBS沖洗2 min×3次;⑥PBS沖洗3次滴加TopoIIα 40～50 μl，4℃冰箱過夜;⑦冰箱內取出標本，PBS沖洗2次，滴加即用型MaxVision檢測試劑40～50 μl，室溫下40 min;⑧DAB顯色:每張切片加兩滴新鮮配制的DAB，在顯微鏡下控制顯色(5～15 min);⑨自來水沖洗;蘇木素復染30 s，鹽酸酒精分化;自來水沖洗;⑩脫水、透明:95%乙醇5 min×1次;70%乙醇5 min×1次;無水酒精5 min×2次;二甲苯10 min×2次;○11封片:切片干燥后，用中性樹膠封固，干燥后顯微鏡下觀察。

1.4 結果判斷 每批實驗均設陽性和陰性對照，TopoIIα表達陽性可見細胞核有棕黃色顆粒樣沉淀，陰性細胞核無棕黃色顆粒樣沉淀。染色分級整張切片無陽性細胞(-)，陽性細胞數(shù)＜10%(+)，陽性細胞數(shù)10% ～50%(++)，陽性細胞數(shù)≥50%(+++)。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TopoIIα在胃癌中的表達。見圖1，表1。TopoIIα在胃腺癌中的表達為53.9%(48/89)。在正常胃組織中的表達為0%。

圖1 TopoIIα在胃癌中的表達

表1 TopoIIα表達與胃癌臨床病理參數(shù)之間的關系(例，%)

2.2 TopoIIα表達與胃癌臨床病理特征間的關系，表1。TopoIIα表達與患者性別、年齡、腫瘤大小無顯著性相關，而與腫瘤部位、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移及臨床分期相關，且在胃賁門處表達高于胃底部，隨著分化程度的增加、淋巴結轉移的增多及腫瘤分期的增加其TopoIIα的表達增強。

3 討論

DNA拓撲異構酶(Topo)普遍存在于各類生物種群中，包括病毒、原生動物、真菌、植物、昆蟲、兩棲類、鳥類及哺乳動物的正常和腫瘤細胞中，參與細胞有絲分裂過程中的DNA轉錄、重組、復制及染色體分離［3-4］，是調節(jié)核酸空間結構動態(tài)變化，控制核酸生理功能的關鍵酶。DNAToPoll主要在細胞核內發(fā)揮生理作用。TopoII又稱回旋酶，最早發(fā)現(xiàn)于1980年，是與細菌DNA回旋酶(gyrase)具有同源性的二聚體蛋白。人類的 TopoⅡ有兩種同工酶，為 TopoIIα和 TopoIlβ。TopoIIα由17號染色體編碼，TopoIlβ則由3號染色體編碼，兩者均可與DNA形成穩(wěn)定的共價復合物。TopoIlα大多位于增殖細胞中，而且在快速增殖細胞中的水平是靜止細胞中的數(shù)倍，在細胞內主要分布于細胞核漿，并多呈網狀結構聚集在染色體著絲粒周圍［5］。TopoIlα參與 DNA的轉錄、翻譯、復制及染色體的分離等過程，主要存在于S2、G2/M期，有兩種功能:一作為細胞的增殖指數(shù)，表達于S2、G2/M期;二作為抗癌藥物的靶點指數(shù)。同時研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中，TopoIIα的表達增高是一個普遍現(xiàn)象，而且臨床方面已逐漸將TopoIIα作為判斷細胞或腫瘤增殖程度的一個標志［6-8］;并且，許多研究發(fā)現(xiàn) TopoIIα 表達與患者的預后有關［9，10］。亦有研究表明，TopoIlα陽性表達與腋窩淋巴結轉移和腫瘤遠處轉移有關［11］。Varis［12］和 Wikman［13］分別發(fā)現(xiàn)，在胃癌和肺癌中TopoIlα的增殖比Her-2更常見。

本研究中TopoIIα的陽性表達率為53.9%，與胃癌的部位有關，胃賁門癌TopoIIα的陽性表達率較高;與胃癌組織的分化程度、淋巴結轉移及胃癌分期相關，低分化者表達顯著高于高中分化，胃癌分期越晚其表達越高，提示組織分化越差，分期越晚，說明其惡性程度高，細胞增殖活躍，存在于S2、G2/M期的TopoIIα量多，陽性率就高，同時也提示耐藥性越低，對化療藥物敏感性高。

TopoII為靶點的抗癌藥較多，根據(jù)作用方式不同分為嵌入型和非嵌入型兩類。嵌入型抑制劑系通過其分子中類似嘌呤堿或嘧啶堿的多環(huán)結構嵌到TopoⅡ與DNA結合部位的雙鏈之間，從而干擾了該酶將DNA斷端重新接合的正常功能，并進一步造成DNA鏈斷裂損傷，導致細胞死亡這一類藥物有蔥環(huán)類抗生素如阿霉素，柔紅霉素，放線菌素，米托蒽醌，安吖啶，咔唑類等［14］。非嵌人型抑制劑其作用模式還不十分楚，可能是直接作用TopoⅡ或是僅僅與雙鏈DNA中的一條鏈結合以影響酶功能。這一類藥物依托泊苷(etoposide)，替尼泊苷(teniposide)等。一般認為TopoII陽性表達越高，化療藥物具備的靶點越多，對抗癌藥物敏感性越高。

TopoⅡ抑制劑引起的由ToPon介導的MDR不典型多藥耐藥(at-MDR)。主要表現(xiàn)在以下幾方面:①TopoIIα基因的位點突變或缺失;②TopoIIα的磷酸化水平提高，已經證實，TopoIIα的高磷酸化與它的催化活性及易解離復合物形成呈負相關;③TopoIIα基因調控異常導致TopoIIα蛋白水平降低。臨床上對腫瘤細胞的治療中如不了解基因TopoIIα水平，盲目使用抗腫瘤藥，易導致腫瘤細胞抗藥性的產生，影響療效。

4 小結

胃癌的發(fā)生和發(fā)展是多因素、多階段的綜合結果，本研究發(fā)現(xiàn)TopoIIα與胃癌的部位、淋巴結轉移、遠處轉移、臨床分期等因素有關。而DNA拓撲酶抑制劑開辟了腫瘤治療的新途徑，其具體療效還需要進一步的臨床試驗研究。TopoⅡ抑制劑引起的由TopoII介導的不典型多藥耐藥(at-MDR)在胃癌的研究中有待于進一步的試驗研究。

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