吳國(guó)清，伍旭明，趙光樹，馬成堅(jiān)

(1.浙江省立同德醫(yī)院，浙江 杭州 310012; 2.浙江省中醫(yī)院，浙江 杭州 310006;3.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州 310009)

仙茅是石蒜科多年生草本植物仙茅 Curculigo orchioides的根莖，是補(bǔ)腎助陽(yáng)的傳統(tǒng)中藥，能補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛寒濕，在治療“骨瘺”“骨痹”“腰背痛”“虛損”等中醫(yī)證候時(shí)常用其加減配伍，但其確切藥理機(jī)制還不明晰。筆者以小鼠成骨細(xì)胞MC3T3－E1為細(xì)胞模型進(jìn)行體外試驗(yàn)，觀察仙茅醇提液對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響。

1 儀器與試藥

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Forma Scientific);倒置相差顯微鏡(日本Olympus，);全自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀(日本DYNEX公司)。仙茅藥材購(gòu)自浙江省杭州市華東醫(yī)藥有限公司藥材參茸分公司。MC3T3－E1細(xì)胞由浙江大學(xué)傳染病研究所保存。3－(4，5－二甲基－2－噻唑)－2，5－二苯基溴化四氮唑鹽(MTT，粉劑，美國(guó)Sigma公司)用磷酸鹽緩沖液配成質(zhì)量濃度為5 g/L的溶液，過濾除菌，4℃避光保存，2周內(nèi)有效。細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司);0.25%胰酶消化液(美國(guó)GIBCO公司)，－20℃保存?zhèn)溆?PAA胎牛血清(上海微科生物有限公司)，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 藥物制備

將仙茅粉碎過20目篩，稱取100 g，以75%乙醇水浴回流提取3次(1 h/次)，回收乙醇，配成大約相當(dāng)于生藥材1 g/mL的儲(chǔ)備液，0.45 μm微膜過濾、除菌，4℃保存?zhèn)溆?。試?yàn)時(shí)用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基依次稀釋成終濃度為 1 ∶250，1 ∶500，1 ∶1 000，1∶1 500的溶液。

2.2 MC3T3－E1細(xì)胞的培養(yǎng)和增殖檢測(cè)

將成骨樣細(xì)胞MC3T3－E1接種于培養(yǎng)瓶中，置37℃、飽和濕度、CO2分壓為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)傳代。選取傳至第3代、生長(zhǎng)旺盛的MC3T3－E1成骨樣細(xì)胞，用4%胎牛血清成骨樣細(xì)胞培養(yǎng)基配制成5×104個(gè)/mL成骨樣細(xì)胞懸液，接種于96孔成骨樣細(xì)胞培養(yǎng)板，貼壁生長(zhǎng)24 h后，移除血清，加入不同梯度濃度的仙茅提取物，每個(gè)濃度4個(gè)復(fù)孔。于37℃和5%CO2培養(yǎng)箱48 h后，每孔加入30 μL MTT溶液(2 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸凈上清液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，振蕩5～15 min，使MTT還原產(chǎn)物結(jié)晶完全溶解，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定每孔光密度值(OD值)，波長(zhǎng)為570 nm。以含有等體積的未加仙茅提取物的細(xì)胞孔測(cè)得的吸光度值為對(duì)照，將不同濃度的加藥組與對(duì)照組之間進(jìn)行均值比較，所得數(shù)據(jù)均經(jīng)ANOVA檢驗(yàn)。細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)組－對(duì)照組)/對(duì)照組×100%。

2.3 結(jié)果

仙茅提取物和MC3T3－E1細(xì)胞共孵育48 h后，低濃度(1∶1 500)對(duì)細(xì)胞增殖沒有影響，中濃度(1∶1 000)對(duì)細(xì)胞增殖影響明顯，隨著藥物濃度的增加，對(duì)MC3T3－E1細(xì)胞增殖的影響也明顯加大。結(jié)果見表1和圖1。

表1 仙茅提取物對(duì)MC3T3－E1細(xì)胞增殖的影響(A值，±s，n=4)

表1 仙茅提取物對(duì)MC3T3－E1細(xì)胞增殖的影響(A值，±s，n=4)

注:與對(duì)照組比較，△P ＜0.05，▲P ＜0.01。

藥物濃度1∶1 500 1∶1 000 1∶500 1∶250加藥組0.83 ± 0.05 0.95 ± 0.06△1.11 ± 0.15△1.33 ± 0.05▲對(duì)照組0.73 ± 0.10增殖率(%)6.0 21.7 51.9 66.3

3 討論

圖1 與仙茅提取物共孵育后MC3T3－E1細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(λ=570 nm)

中醫(yī)理論認(rèn)為，腎與骨的關(guān)系非常密切?！端貑栃魑鍤庹摗氛f(shuō):“五臟所主，腎主骨。”《素問·應(yīng)象大論》說(shuō):“腎生骨髓，腎精充足，則骨髓生化有源，骨得髓的充分滋養(yǎng)而堅(jiān)固有力?！备鶕?jù)“腎主骨”理論，補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨的仙茅常配伍加減用于“骨瘺”“骨痹”“腰背痛”“虛損”等癥，且取得一定效果[1－2]。在骨折修復(fù)和骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展中，成骨細(xì)胞扮演著關(guān)鍵角色。MC3T3－E1細(xì)胞株是1981年Sudo H和Kodama HA等[3]從新生C57BL/6小鼠顱蓋骨中分離培養(yǎng)建株的成骨細(xì)胞株，該細(xì)胞株具有體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的各種生物學(xué)特性，包括堿性磷酸酶(ALP)活性、Ⅰ型膠原合成和基質(zhì)鈣化等特性，常作為骨代謝研究的細(xì)胞模型。

本研究結(jié)果表明，仙茅提取物能明顯促進(jìn)MC3T3－E1成骨細(xì)胞的增殖，且增殖影響大小與其濃度有密切關(guān)系。因此加速成骨細(xì)胞的增殖與分化，增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性，使骨量增加，促進(jìn)骨修復(fù)和骨形成，可能是仙茅能用于骨質(zhì)疏松癥治療的部分機(jī)制，這也與很多抗骨質(zhì)疏松的“補(bǔ)腎”中藥研究報(bào)道相符[4－7]。

仙茅中含有皂苷類、酚類、木脂素類、黃酮類、桉烷類、甜味蛋白和多糖類成分[8]，仙茅苷是其最主要的活性成分。本研究采用的是仙茅粗提物，具體是哪一個(gè)活性單體對(duì)MC3T3－E1細(xì)胞具有增殖活性，其是否影響成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等的表達(dá)等確切內(nèi)在機(jī)制，尚需在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探討。

[1]王長(zhǎng)海，張仲海.二仙湯治療骨質(zhì)疏松癥50例[J].陜西中醫(yī)，1998，15(5):205.

[2]張貴有.二仙湯治療腰痛驗(yàn)案舉隅[J].實(shí)用中醫(yī)藥雜志，2007，23(6):381.

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