曲 翊, 宋悅凡, 曹旭鵬, 張 衛(wèi),3

（1. 中國科學院 研究生院, 北京 100039; 2. 中國科學院 大連化學物理研究所, 遼寧 大連 116023; 3. 澳大利亞Flinders大學 海洋生物過程及生物產品研究中心, 阿德萊德 SA 5042）

繁茂膜海綿原細胞形態(tài)學識別及分離純化特點

曲 翊1,2, 宋悅凡1,2, 曹旭鵬2, 張 衛(wèi)2,3

（1. 中國科學院 研究生院, 北京 100039; 2. 中國科學院 大連化學物理研究所, 遼寧 大連 116023; 3. 澳大利亞Flinders大學 海洋生物過程及生物產品研究中心, 阿德萊德 SA 5042）

利用透射電鏡對繁茂膜海綿（Hymeniacdidon pelevis）的原細胞進行觀察, 確定其超微結構特點為:細胞核大, 核仁顯著。細胞質中富含線粒體和處于不同消化階段的溶酶體。對繁茂膜海綿本體和芽體旺盛分生組織進行觀察, 發(fā)現(xiàn)原細胞在不同組織中形態(tài)多變。同時針對不同部位分別進行組織離散和原細胞富集, 結果證明不同來源的富集原細胞團在原細胞比例和生長分化過程中都存在差異。

繁茂膜海綿（Hymeniacdidon pelevis）; 原細胞

海綿是海洋中最低等的多細胞動物, 近年來從海綿中發(fā)現(xiàn)了大量的生物活性物質, 使海綿成為了海洋藥物研究中重要的藥源生物[1]。為解決在海綿藥物開發(fā)過程中的生物量供給問題, 近10年來國際上開展了一系列研究以解決海綿資源供給不足問題。海綿細胞離體培養(yǎng)因其可能利用細胞工程和基因工程技術實現(xiàn)活性物質的代謝調控, 從而可能實現(xiàn)活性物質的大規(guī)?？煽厣a, 成為近年來無脊椎動物細胞培養(yǎng)領域的一個研究熱點[2]。

海綿沒有組織和器官的分化, 不同類型的細胞能保持功能和結構上的相對獨立。目前可以確定的細胞類型有上皮細胞（epithelial cells）、吞噬細胞（phagocytes）、領細胞（choanocytes）、膠原細胞（collencytes）、原細胞（archeaocytes）等十幾種。做為海綿體內的“干細胞”, 原細胞是海綿中不可缺少的細胞類型, 具有低分化、高增殖潛力的特點, 是最理想的海綿細胞離體培養(yǎng)對象[3]。但海綿原細胞在海綿體內數(shù)量少, 形態(tài)多變, 不易確認, 給細胞培養(yǎng)工作造成了一定困難。作者采用石蠟切片和透射電子顯微鏡法對中國黃海繁茂膜海綿（Hymeniacidon perlevis）本體組織和芽體中的原細胞進行識別, 并針對海綿不同部位進行原細胞分離純化結果的比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料

繁茂膜海綿采自大連凌水橋黃海海域潮間帶,自然狀態(tài)下為片狀生長。當處于生殖準備階段時, 會改變形態(tài), 出現(xiàn)芽狀生長（圖1）。

圖1 室內養(yǎng)殖狀態(tài)下的繁茂膜海綿Fig. 1 Hymeniacdidon pelevisin aquarium

1.2 方法

1.2.1 海綿組織離散及原細胞富集

制備過程參照Custodio[4]介紹的方法, 根據(jù)繁茂膜海綿自身特征進行部分修改, 具體過程為: 室溫條件下, 海綿在天然海水（含 25×10?6CuSO4）中浸泡3～5 h, 同時進行磁力攪拌。將處理后的海綿切成1 cm左右小塊, 在無鈣鎂海水中振蕩5次, 棄上清,再重復振蕩5次。

將前處理完畢的組織放入含10 μmol/L EDTA的無鈣鎂海水中, 振蕩5 min, 300目濾網過濾。濾液經800 r/min離心5 min 后棄上清, 加入無鈣鎂海水清洗細胞, 反復兩次。向混合細胞中加入無鈣鎂海水并輕輕吹打, 待細胞混合均勻后靜置12～24 h以進行選擇性聚集。將選擇性聚集形成的細胞聚集體在天然海水中培養(yǎng)以進行差速貼壁。24 h后使用含10 μmol/L EDTA的無鈣鎂海水將分布于細胞聚集體上層的原細胞離散下來。離散時間由鏡檢控制。離散后的細胞液經低速離心后再經 Ficol-泛影葡胺密度梯度離心。收集ρ=1.09 ～ 1.11的細胞, 由無菌海水稀釋至106個/mL, 接種培養(yǎng)。

1.2.2 原細胞電鏡樣品的制備

取 1 mL富集原細胞樣品。參考 Mannuel的方法[5], 使用 2.5%戊二醛溶液（pH7.4）在室溫下固定2 h。固定后細胞經鋨酸固定、酒精丙酮梯度脫水、環(huán)氧樹脂定向包埋。切片經醋酸鈾-檸檬酸鉛染色,由透射電子顯微鏡（JEM-2000EX, JEOL, Japan）觀察。

1.2.3 海綿組織切片的制備

取繁茂膜海綿本體和芽體, 經10%甲醛固定30 min后再由5%氫氟酸消化骨針5 h。處理后的樣品經梯度脫水、浸蠟后進行常規(guī)切片, HE染色, 中性樹膠封片。

2 實驗結果

2.1 原細胞的超微結構

如圖 2所示, 繁茂膜海綿原細胞在離散狀態(tài)下呈圓形或橢圓形, 在聚集狀態(tài)下細胞發(fā)生變形。原細胞與周邊細胞之間的界限明顯, 細胞核大, 具有雙層核膜, 核仁顯著。細胞質淡染, 細胞器多, 富含線粒體及各個階段的溶酶體。

2.2 海綿本體組織的形態(tài)學觀察

從海綿本體HE染色的石蠟切片（圖3）中可以看到游離于中膠層的原細胞。細胞形態(tài)巨大, 形態(tài)多變,細胞核與核仁明顯。海綿組織中骨針束（Bundle）含量豐富, 經酸消化后可以看到與參與骨針束固定的膠原物質。

2.3 海綿芽體的組織形態(tài)學觀察

圖4是海綿芽體的HE染色結果, 處于生長狀態(tài)的海綿組織具有較為豐富的變形拖尾細胞, 該類細胞正是正在向膠原細胞轉化的原細胞, 具有顯著的變形特征: 多為梭形, 拖尾明顯。鏡下觀察表明, 芽體外扁平細胞層不如本體組織明顯, 有外皮結構。整個芽體的骨針含量低于本體組織。繁茂膜海綿特征性的骨針束結構（Bundle）在芽體中含量較低。大芽與小芽相比, 骨針含量更低, 組織結構更致密。水溝系統(tǒng)發(fā)育更為完善。

2.4 不同材料來源對原細胞分離結果的影響

圖5所示為分離純化各步的原細胞含量（%）。與本體組織分離純化結果相比, 采用芽體進行細胞分離純化可以得到更高純度的富集原細胞。經差速貼壁去除上皮和膠原后, 采用兩步法進行原細胞的富集純化: （1）低速離心; （2）密度梯度離心。經低速離心純化后, 來源于本體的原細胞純度為 51.34%, 來源于芽體的細胞純度為63.58%,T檢驗結果表明, 兩者差異極顯著（P＜0.01）。將低速離心得到的細胞體系再經密度梯度離心法進行純化, 可以得到純度更高的富集原細胞體系。來源于本體的原細胞純度為72.25%, 來源于芽體的原細胞純度為80.41%,T檢驗結果表明, 兩者差異顯著（P＜0.05）。

圖3 海綿本體組織Fig. 3 Tissue of Hymeniacdidon pelevis

圖4 海綿芽體Fig. 4 Bud of Hymeniacdidon pelevis

圖5 不同材料來源的原細胞純化結果Fig. 5 Purification of archeaocytes from tissue and bud

2.5 不同材料來源對細胞培養(yǎng)結果的影響

來源于本體和來源于芽體的原細胞在成團和貼壁分化能力上都存在差異（圖6）。源于本體的細胞成團較小, 易貼壁, 在差速貼壁階段, 細胞團在24 h之內全部貼壁鋪展, 光鏡下可見大量上皮細胞貼壁和原細胞遷出現(xiàn)象, 細胞團之間也通過膠原和上皮的貼附現(xiàn)象彼此連接。經低速離心和密度梯度純化之后, 富集原細胞成團速度較快, 在培養(yǎng)至 72 h出現(xiàn)貼壁分化現(xiàn)象。來源于芽體的細胞成團較大, 但貼壁分化能力較弱。在差速貼壁階段, 細胞團在24 h之內全部貼壁, 但具有明顯膠原細胞遷出現(xiàn)象的細胞團不足50%, 細胞團之間也沒有彼此連接現(xiàn)象。經低速離心和密度梯度純化之后, 富集原細胞成團速度快, 細胞團大于來源于本體的細胞團。在培養(yǎng)過程中,細胞團通過彼此匯合達到體積增大, 在72 h之內出現(xiàn)光滑上皮, 但直至培養(yǎng)第 6 天也沒有出現(xiàn)細胞團貼壁現(xiàn)象。

圖6 原細胞富集體系培養(yǎng)結果Fig. 6 Primary culture of archeaocytes

3 討論

原細胞是海綿組織中必不可少的一種細胞, 被認為是海綿體內的干細胞[6], 在海綿生長的不同生理狀態(tài)可以向不同的細胞類型轉化。但海綿組織中的原細胞較為稀少。只有在特殊的情況下, 例如生殖,出芽, 組織修復等情況下原細胞才會聚集于某些區(qū)域[2]。繁茂膜海綿的生長具有周期性, 具有明顯的出芽現(xiàn)象。原細胞在芽體（bud）與本體（mother sponge）中的不同形態(tài), 表現(xiàn)出原細胞的形態(tài)多變性。尤其在芽體中由于生長旺盛, 向膠原細胞分化, 細胞變形為梭形, 常有膠原拖尾, 是原細胞向膠原細胞分化的顯著標志。芽體發(fā)育過程起始于細長的小芽（Filament）。在發(fā)育過程中, 小芽的末端逐漸膨大, 直至形成明顯芽體后隨著斷裂作用脫離本體。游離的芽會尋找合適的附著基, 一旦附著, 便會繼續(xù)發(fā)育成海綿。細長小芽的組織切片結果表明, 扁平細胞層結構不明顯, 小芽內部的原細胞含量多于本體組織。當細長小芽發(fā)育成大芽時, 隨著發(fā)育的成熟, 芽體中的細胞類型也會發(fā)生顯著變化, 形成以原細胞為主的細胞構成方式。一個發(fā)育完全成熟的芽體外皮層被裹在扁平細胞中, 在外皮層內部具有豐富的膠原。

原細胞具有運動性, 同時具有消化和吞噬功能。通常在領細胞周圍會匯聚大量原細胞, 將領細胞捕獲到的食物進行吞噬消化, 以供整個機體生長發(fā)育所需。同時消化后的廢物可以通過原細胞的胞吐作用經水溝系統(tǒng)排出體外。電鏡下觀察到的細胞超微結構可以證明原細胞強大的吞噬能力: 胞質中充滿大量吞噬體及各個階段的溶酶體。而且, 原細胞的線粒體數(shù)量多, 可以為吞噬消化過程提供大量能量,使原細胞在外源性和內源性物質的降解和循環(huán)中發(fā)揮重要作用。超微結構證實, 原細胞的核比例大, 具有明顯核仁, 攜帶大量遺傳物質, 是一類具有增殖潛能的細胞。培養(yǎng)結果證實, 隨著純度增加, 細胞成團速度加快, 證明原細胞的細胞活力強, 適于進行體外培養(yǎng)。不同來源的細胞體系在細胞培養(yǎng)中存在明顯差異: 在差速貼附階段, 來源于本體的細胞體系具有更強的貼壁及遷移能力。這一現(xiàn)象可能與海綿組織中的細胞比例有關, 光鏡結果表明繁茂膜海綿具有明顯的外骨骼（Cortex）和典型的扁平細胞層,由于生長在潮間帶, 風浪沖擊作用較強, 所以外骨骼連接緊湊, 扁平細胞數(shù)量多, 細胞層致密。在差速貼附過程中, 本體由于其扁平細胞比例高, 更易出現(xiàn)貼壁現(xiàn)象。而芽體的扁平細胞層不明顯, 細胞比例低, 貼壁遷移現(xiàn)象不明顯。隨著原細胞純度的不斷增加, 細胞培養(yǎng)規(guī)律更趨近于小細胞彼此匯合成大團,貼壁能力減弱。這可能與原細胞的分化方向有關, 需要進一步的實驗驗證。

從本體和芽體分別進行細胞離散純化, 結果證明從芽體中更易獲得高純度的原細胞, 而且更易保持其未分化的狀態(tài)。這一結果可以為原細胞培養(yǎng)建系提供一條有希望的探索途徑。由于海綿原細胞的形態(tài)多變, 以往對原細胞的觀察鑒定一直沒有定論。本文通過同時對比不同生長狀態(tài)的組織中的原細胞的形態(tài)和結構特征, 對海綿原細胞的各種存在形態(tài)有所判定, 為深入研究海綿原細胞提供必要的信息。

[1] Müller W E G, Wiens M, Batel R, et al. Establishment of a primary cell culture from a sponge: Primmorphs fromSuberites domuncula[J]. Marine Ecol Progr Ser,1999, 178: 205-219.

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[5] Manuel M, Ana R. Reproductive output in a Mediterranean population of the homosclerophoridCorticium candelabrum（Porifera, Demospongiae）, with notes on the ultrastructure and behavior of the larva[J]. Marine Ecology, 2008, 29（2）: 298-316.

[6] Liming Sun, Yuefan Song, Yi Qu, et al. Purification and in vitro cultivation of archaeocytes （stem cells） of the marine spongeHymeniacidon perleve（Demospongiae）[J]. Cell Tissue Res, 2007, 328（1）: 223-237.

Received: Feb., 25, 2010

Key words:Hymeniacdidon pelevis; archeaocyte

Abstract:Archeaocytes in Hymeniacdidon pelevis were observed by normal light microscope and transmission electron microscope. The results showed that archeaocyte has numerous mitochondria, phagosomes and lysosomes in several stages of digestion. The morphological results show that the shape of archeaocytes changes in different tissues. The cell culture data shows that archeaocytes from different origins have distinguishing difference in growth and differentiation behaviors.

（本文編輯:梁德海）

Histological characterization and purification of archeaocytes of marine sponge Hymeniacdidon pelevis

QU Yi1,2, SONG Yue-fan1,2, CAO Xu-peng2, ZHANG Wei2,3

（1. Graduate School of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China; 2. Marine Bioproducts Engineering Group, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China; 3. Flinders Centre for Marine Bioprocessing and Bioproducts, Flinders University, Adelaide SA5042, Australia ）

Q24

A

1000-3096（2011）01-0001-05

2010-02-25;

2010-05-24

國家高技術研究發(fā)展計劃項目（2006AA09Z435）

曲翊（1978-）, 女, 遼寧大連人, 博士研究生, 研究方向為生物化工, 電話: 0411-84379527, E-mail: qyi@dicp.ac.cn; 張衛(wèi), 通信作者,E-mail: weizhang@dicp.ac.cn