高鳳祥, 郭 文, 潘 雷, 胡發(fā)文, 菅玉霞, 張少春, 王 雪

（山東省海水養(yǎng)殖研究所, 山東 青島 266071）

幾種益生菌對大菱鲆幼魚生長及消化酶活性的影響

高鳳祥, 郭 文, 潘 雷, 胡發(fā)文, 菅玉霞, 張少春, 王 雪

（山東省海水養(yǎng)殖研究所, 山東 青島 266071）

作者以初體質(zhì)量為（4.80±0.11）g的大菱鲆（Scophthalmus maximus）為研究對象, 在循環(huán)水水族箱中進行 60 d飼喂實驗, 研究餌料中添加單一益生菌和復(fù)合益生菌對大菱鲆生長及消化道酶活性的影響。以基礎(chǔ)飼料為對照組, 在基礎(chǔ)飼料中分別添加枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、復(fù)合芽孢桿菌組（1 : 1）、嗜酸乳酸桿菌（Lactobacillus acidophilus）、雙歧桿菌（Bifidobacterium inopinatum）、復(fù)合乳酸菌組（1 : 1）、復(fù)合益生菌（1 : 1 : 1 : 1）, 每克飼料約含菌3.0×109個/g干質(zhì)量, 共配制 7種實驗飼料。實驗結(jié)果顯示, 復(fù)合益生菌飼喂組大菱鲆的存活率和特定生長率顯著高于對照組（P＜0.05）, 而單一益生菌飼喂組與對照組差異不顯著（P＞0.05）。飼料中添加益生菌能使大菱鲆消化道蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力升高, 其中添加復(fù)合益生菌的實驗組消化道酶活性顯著高于對照組（P＜0.05）。上述實驗結(jié)果表明, 與飼喂單一益生菌相比, 添加復(fù)合益生菌對提高大菱鲆存活率, 促進大菱鲆的生長具有更顯著的促進作用。

大菱鲆（Scophthalmus maximus）; 益生菌; 生長; 消化酶活性

大菱鲆（Scophthalmus maximus）作為一種低溫經(jīng)濟魚類, 1992年被引入中國, 由于其生長速度快, 肉質(zhì)好, 養(yǎng)殖和市場潛力大等優(yōu)勢, 近年來已成為中國北方沿海重要的養(yǎng)殖品種。但隨著大菱鲆集約化養(yǎng)殖的迅猛發(fā)展, 由于片面的追求經(jīng)濟效益, 養(yǎng)殖密度過大, 養(yǎng)殖水體中自然生態(tài)體系的平衡被打破,自身污染嚴(yán)重。此外, 由于工業(yè)廢水、生活污水的亂排亂放, 導(dǎo)致養(yǎng)殖水環(huán)境惡化, 養(yǎng)殖對象病害頻發(fā)。

養(yǎng)殖業(yè)者目前多數(shù)依賴廣譜性抗生素來控制病害的發(fā)生, 但由于抗生素本身不僅殘留性強, 更會引起細(xì)菌抗藥性, 從而進一步破壞養(yǎng)殖水域正常生物區(qū)系的平衡, 嚴(yán)重影響了大菱鲆產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。事實上, 長期使用抗生素和其他化學(xué)藥物防治養(yǎng)殖病害已引發(fā)了一系列環(huán)境和社會問題[1-2]。為解決養(yǎng)殖病害和食品安全等諸多矛盾, 尋找新的綠色環(huán)保的抗生素替代品是目前的研究熱點。

益生菌（Probiotics）是指在一定濃度范圍內(nèi)可以增進健康的活體微生物制劑, 作為抗生素的替代品, 其應(yīng)用在近幾年已得到迅速發(fā)展。綜合目前文獻的報道,大多數(shù)益生菌的益生作用主要體現(xiàn)在防治消化道疾病、幫助消化吸收和刺激免疫系統(tǒng)3個方面[3-5], 非常適合做為水產(chǎn)品的餌料添加劑。將益生菌直接添加到養(yǎng)殖水體中, 可用于防止水產(chǎn)品被病原微生物感染、調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水體的微生態(tài)環(huán)境, 改善局部水體環(huán)境,達到健康養(yǎng)殖、穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的方法已初顯成效。

益生菌一般由多種有益微生物組成, 主要包括芽孢桿菌（Bacillusspp.）、乳酸菌（Lactobacillusspp.）、弧菌（Vibriospp.）和酵母菌（Saccharomycesspp.）等。大多數(shù)的益生菌是從水生動物腸道內(nèi)以及自然養(yǎng)殖水體中分離純化得到的, 對養(yǎng)殖生物不具有生態(tài)危害性, 在目前的水產(chǎn)養(yǎng)殖中已經(jīng)廣泛應(yīng)用[6-7]。

首例被用于水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)實踐中的益生菌是芽孢桿菌, Laurent等[8]在1998年把它應(yīng)用于日本鰻鱺（Anguilla japonica）養(yǎng)殖中, 將其投放到養(yǎng)殖水體中從而減少了由病原菌（Edwardsiellasp.）引起的鰻魚大量死亡。芽孢桿菌是一種非致病菌, 可耐酸、耐堿、耐高溫和擠壓, 是所有益生菌中穩(wěn)定性最強的一種。芽孢桿菌以內(nèi)孢子的形式存在于腸道微生物群落中,孢子在生長過程中能產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸等揮發(fā)性脂肪酸, 可降低消化道內(nèi) pH和氨的含量, 同時還能產(chǎn)生大量的維生素B和維生素C[9]。

水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)實踐中另一種常用益生菌是乳酸菌, 厭氧或兼性厭氧, 不能形成芽孢, 穩(wěn)定性較低。乳酸菌如果在魚腸道系統(tǒng)大量定植, 可以抵抗革蘭氏陰性致病菌（Vibrio anguillarum）, 增強機體抗感染能力, 增加腸黏膜的免疫調(diào)節(jié)活性, 促進魚類生長,提高抗病力[10]。從牙鲆（Paralichthys oliuaceus）腸道分離的乳酸菌, 可以降低水中和腸道中有害菌的數(shù)量, 提高成活率, 促進生長[11]。

石軍等[12]指出, 乳酸菌能分泌細(xì)菌素、H2O2、有機酸等物質(zhì), 可降低消化道環(huán)境pH值而抑制腸道有害微生物的生長和繁殖, 這與 Ring[13]和 Lewus等[14]的結(jié)論相似, 也與陸生動物益生菌細(xì)菌素的研究結(jié)論相似。

作者以大菱鲆幼魚為研究對象, 旨在探討大菱鲆苗種培育養(yǎng)殖生產(chǎn)實踐中, 在飼料中直接添加單一及復(fù)合種類的常見益生菌對大菱鲆幼魚的生長以及對部分免疫指標(biāo)的影響, 從而為益生菌在大菱鲆養(yǎng)殖中的直接應(yīng)用提供理論依據(jù)。本次實驗選用的芽孢桿菌種類為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）, 選用的乳酸菌種類為嗜酸乳酸桿菌（Lactobacillus acidophilus）和雙歧桿菌（Bifidobacterium inopinatum）。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚及分組

實驗于2008年4月15日至6月15日在山東省海水養(yǎng)殖研究所中試基地實驗室進行, 實驗用大菱鲆體質(zhì)健康, 體長5～6 cm。在海水良種繁育中心實驗室暫養(yǎng)一周后隨機分為8組: 對照組、枯草芽孢桿菌組、地衣芽孢桿菌組、地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌（質(zhì)量比為1∶1）、嗜酸乳酸桿菌組、雙歧桿菌組、嗜酸乳酸桿菌+雙歧桿菌（質(zhì)量比為1∶1）組、地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌+嗜酸乳酸桿菌+雙歧桿菌（質(zhì)量比為組。每組3個重復(fù), 每個重復(fù)100尾魚, 養(yǎng)殖在循環(huán)水水族箱中。

1.2 實驗用飼料

基礎(chǔ)飼料以魚粉、豆粕為主要原料配制飼料, 8組實驗組除分別添加了不同菌種及比例的菌液外,各種營養(yǎng)成分均相同（實驗中枯草芽孢桿菌及地衣芽孢桿菌單菌菌液購自山東濟南大吉飼料有限公司,菌含量不小于 1010CFU/mL; 嗜酸乳酸桿菌及雙歧桿菌干粉購自江蘇沃爾德實業(yè)有限公司, 菌含量不小于 1010CFU/g）。

實驗組是把菌液直接加入飼料中, 制成濕顆粒,于 40℃烘至半干, 然后在?20℃冰箱保存, 以備投喂。飼料約含菌3.0×109個/g干質(zhì)量。

日投喂量為體質(zhì)量的5%～10%, 分2次投喂。

1.3 飼養(yǎng)管理

分組后的實驗用魚養(yǎng)殖在循環(huán)水水族箱中, 每天換水 2次, 每次換水 1/2。每天投餌兩次, 分別為7:30～8:30, 16:30～17:30, 投喂量以飽食為標(biāo)準(zhǔn)。每箱魚投喂的飼料于投喂前和投喂后稱質(zhì)量。每次投喂前先吸取糞便, 投喂后吸取殘餌, 將殘餌過濾烘干保存, 以備計算攝食量。飼養(yǎng)條件恒定（水溫17℃±1℃, 鹽度32±0.2）, 實驗共進行60 d。

1.4 生長指標(biāo)測定

實驗起始、實驗中期（第30天）和實驗結(jié)束（第60天）時分別對各組幼魚進行稱質(zhì)量。飼料常規(guī)成分分析參照AOAC[15]的方法。

特定生長率（special growth rate, 簡稱SGR）計算公式如下:

Wf、Wi分別表示平均終體質(zhì)量（g）、平均初體質(zhì)量（g）;T表示飼養(yǎng)時間（d）;

1.5 消化道酶活性的測定

1.5.1 粗酶液制備

第30天時, 每養(yǎng)殖箱各取3尾魚測定酶活性。將活的大菱鲆魚置于預(yù)先準(zhǔn)備好的冰盤上解剖, 從魚的肛門處剪開, 使其內(nèi)臟暴露, 拉出整個消化道,截取胃至肛門前2～3 mm的消化道, 分別剪取胃、幽門盲囊, 將腸的非膨脹部分一分為二, 分為小腸前段, 小腸后段。具體作法如下: 每克組織加入滅菌的10 mL pH7.5的磷酸緩沖液, 在冰浴中勻漿。勻漿液于4℃靜置1 h, 取上清液部分, 于 4℃、4 000 r/min離心30 min, 取上清液測定酶活性。

1.5.2 蛋白酶活性的測定

參照中山大學(xué)[16]Folin-酚法進行, 用上海分析儀器有公司生產(chǎn)的7230型分光光度計測定。蛋白酶活力單位定義為:在pH值7.5（測胃蛋白酶pH2.5）, 底物酪蛋白濃度為5 g/L, 37 ℃條件下, 保溫15 min, 以每克組織蛋白酶每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生 1μg酪氨酸為一個活力單位（U）。

1.5.3 脂肪酶活性的測定

參照中山大學(xué)[16]和周玉言等[17]方法。用聚乙烯醇橄欖油乳化液水解法。脂肪酶活性定義為在pH7.5時, 37 ℃保溫60 min, 以每克組織蛋白酶每分鐘催化聚乙烯醇橄欖油產(chǎn)生1μmoL脂肪酸為1個脂肪酶活性單位（U）。

1.5.4 淀粉酶活性的測定

參照上海市醫(yī)學(xué)化檢所碘—淀粉顯色法[18]。淀粉酶活性定義為在pH7.0時, 37 ℃條件下, 保溫15 min內(nèi), 以每克組織蛋白酶每分鐘完全水解1 mg可溶性淀粉為1個淀粉酶活性單位（U）。

在進行生物輻射影響評價時，經(jīng)常會用到分級的評價結(jié)構(gòu)。較低層級的評價頗為保守，但只需要極少的數(shù)據(jù)輸入，多用于初步篩選；較高層級的評價則更為接近現(xiàn)實情況，結(jié)果更加準(zhǔn)確，但相應(yīng)的也需要更多的數(shù)據(jù)，尤其是當(dāng)?shù)氐臏y量數(shù)據(jù)。在進行生物輻射影響評價時，通常會先采用較低層級的方法來進行篩選，對于可能出現(xiàn)影響的情況再進行高層級地仔細(xì)評價。

2 實驗結(jié)果

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析。當(dāng)差異顯著時, 用Duncan檢驗法進行多重比較,差異顯著度P為0.05,P＜0.05說明有顯著差異。

2.1 對大菱鲆幼魚生長情況的影響

實驗中期（第 30天）各實驗組與對照組大菱鲆生長情況見表1。飼料中添加益生菌能不同程度地促進大菱鲆生長, 其中飼喂復(fù)合益生菌能顯著提高大菱鲆的存活率和特定生長率（P＜0.05）, 其中地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌+嗜酸乳酸桿菌+雙歧桿菌的復(fù)合益生菌組與對照組差異顯著（P＜0.05）, 存活率也顯著提高。

實驗?zāi)┢冢ǖ?60天）各實驗組與對照組大菱鲆生長情況見表2。在飼料中添加復(fù)合益生菌仍能顯著提高大菱鲆幼魚的存活率和特定生長率, 其中嗜酸乳酸桿菌+雙歧桿菌組和地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌+嗜酸乳酸桿菌+雙歧桿菌的復(fù)合益生菌組與對照組差異顯著（P＜0.05）。

整個實驗階段各實驗組與對照組大菱鲆生長情況見表3。添加益生菌的各實驗組存活率, 特定生長率都有不程度的提高。其中使用復(fù)合益生菌的 3組特定生長率與對照組差異顯著（P＜0.05）。 嗜酸乳酸桿菌+雙歧桿菌組和地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌+嗜酸乳酸桿菌+雙歧桿菌的復(fù)合益生菌組的存活率,特定生長率與對照組相比均有顯著提高（P＜0.05）。

表1 實驗中期大菱鲆存活率及特定生長率（第0～30天）Tab. 1 Survival and special growth rates ofScophthal musmaximusafter different dietary administrations of probiotics （0～30day） n=3; X±SE

表2 實驗?zāi)┢诖罅怫掖婊盥始疤囟ㄉL率（第30～60天）Tab. 2 Survival and special growth rates ofScophthal musmaximusafter different dietary administrations of probiotics （30～60 day） n=3; X±SE

表3 實驗全期大菱鲆存活率及特定生長率（第0～60天）Tab. 3 Survival rate （SR） and special growth rate （SGR） ofScophthal musmaximusafter different dietary administrations of probiotics （0～60day） n=3; X ±SE

2.2 對消化道蛋白酶活性的影響

添加了益生菌的各實驗組均能提高大菱鲆幼魚消化道中蛋白酶活性見表4, 其中添加了地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌+嗜酸乳酸菌+雙歧桿菌的兩個復(fù)合益生菌實驗組與對照組相比差異最為顯著（P＜0.05）, 效果最好。

表4 不同益生菌成分對大菱鲆消化道蛋白酶活性的影響Tab. 4 Effect of different dietary administrations of probiotics on the proteases activity in digest tract ofScophthal Musmaximus n=3; X±SE

2.3 對消化道脂肪酶活性的影響

添加了益生菌的各實驗組均能提高大菱鲆幼魚消化道中脂肪酶活性見表5。整體來看, 添加乳酸菌益生菌的實驗組在提高消化道脂肪酶活性方面效果要好于添加芽孢桿菌的實驗組。添加單一及復(fù)合乳酸菌的實驗組之間差異不大（P＞0.05）。

2.4 對消化道淀粉酶活性的影響

添加益生菌的各實驗組與對照組的消化道淀粉酶活性見表6。其中添加單一芽孢桿菌的兩個實驗組與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。其他實驗組與對照組差異較為顯著（P＜0.05）, 但其他實驗組之間差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

在本研究中, 飼料中添加益生菌均能促進大菱鲆幼魚生長, 與 Gatesoupe[19]的研究結(jié)果相似, 此外, 其他在水產(chǎn)動物的飼料中添加益生菌的相關(guān)研究也取得了相似的結(jié)論, 如斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）[20]、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）[21]、鯉魚（Cyprinus carpio）[22]、銀鯽（Carassius auratus）[23]以及牙鲆（Paralichthys olivaceus）[24]。

Smoragiewicz等[25]發(fā)現(xiàn)定居于胃腸道的菌群可以作為營養(yǎng)成分被宿主吸收, 同時宿主也可以把一些環(huán)境中的有毒物質(zhì)以及食物中的無營養(yǎng)成分分解為養(yǎng)料吸收。Douillet等[26]研究認(rèn)為腸道菌可提供幼體生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì), 促進動物生長, 提高成 活率。

表5 不同益生菌成分對大菱鲆消化道脂肪酶活性的影響Tab. 5 Effect of different dietary administrations of probiotics on the lipase activity in digest tract ofScophthal musmaximus n=3; X ±SE

表6 不同益生菌成分對大菱鲆消化道淀粉酶活性的影響Tab. 6 Effect of different dietary administrations of probiotics on the amylase activity in digest tract ofScophthal musmaximus n=3; X±SE

相關(guān)研究表明, 作為餌料添加劑的許多益生菌,除了本身可以幫助動物對食物進行消化, 提高飼料的利用效率之外, 其菌體本身就含有大量的營養(yǎng)物質(zhì), 如酵母菌、光合細(xì)菌等含有豐富的菌體蛋白和多種維生素等微量營養(yǎng)物質(zhì)、可以供給動物生長需要[27]。雖然益生菌的作用更多在于其對體內(nèi)微生態(tài)的調(diào)節(jié), 并改善宿主動物的健康狀況, 但它的營養(yǎng)作用也是值得注意的。

益生菌對大菱鲆幼魚的促生長機理可能與飼喂益生菌后對大菱鲆腸道消化酶活性的提高有關(guān)[11]。本研究結(jié)果表明, 飼料中添加各種益生菌均能提高大菱鲆幼魚消化道酶活性, 其活性大小與生長表現(xiàn)為一定的相關(guān)性。復(fù)合芽孢桿菌在提高大菱鲆幼魚消化道蛋白酶活性方面效果更為顯著, 而乳酸菌在提高大菱鲆幼魚消化道脂肪酶及淀粉酶方面效果更為明顯。

在本實驗中復(fù)合益生菌組有比單一益生菌更好的生長效果, 這一結(jié)果與 Salinas等[28]在烏頰魚（Sparus auratus）中發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌和乳酸菌的復(fù)合菌比單一的芽孢桿菌和乳酸菌有更好的添加效果相似。這可能是因為不同細(xì)菌在腸道微生物區(qū)系中占有不同的生態(tài)位, 相互之間制約、平衡而不至于某一菌種成為優(yōu)勢種而破壞腸道微環(huán)境的平衡, 因而添加復(fù)合益生菌組有比添加單一益生菌更好的免疫及生長效果。

4 結(jié)論

本實驗條件下, 飼料中添加益生菌可促進大菱鲆幼魚生長, 提高消化道酶活性, 并且添加復(fù)合益生菌的效果要好于單一益生菌, 這一結(jié)果對實際養(yǎng)殖生產(chǎn)和商業(yè)餌料中益生菌的添加均有指導(dǎo)作用。在實際應(yīng)用中, 可將幾種益生菌復(fù)合使用, 關(guān)于使用的最佳比例, 還有待于進一步的研究。

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Received: Jan., 15, 2010

Key words:Scophthal musmaximus; probiotics; growth; digestive enzyme activity

Abstract:Experiments were conducted to determine the effects of different dietary administration of Probiotics on growth （SR: survival rate; SGR: special growth rate） and digestive enzyme activitis （including proteases、lipase and amylase） ofScophthal musmaximus.The initial body weight was（4.80±0.11）, and the period of the experiment was 60 d. Basic diet was made of fish meal and defatted soybean meal as main protein sources. These juvenile turbots were fed with eight different diets: basic diet as control, and basic diet supplemented with 3.0×109CFU/g single probiotics （Bacillus subtilis,Bacillus licheniformis, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium inopinatum） or 3.0×109CFU/g compound probiotics （B.licheniformis + B.subilis1 : 1;B. inopinatum + L. acidophilus1 : 1;B.licheniformis + B.subilis + B. inopinatum + L. acidophilus1 : 1 : 1 : 1）. Each diet was randomly fed to triplicate groups of 300 turbots reared in circulating water aquarium. The water temperature was 17℃±1℃ and the salinity was 32±0.2 during the experimental period. The results showed that turbot fed compound probiotics showed relatively higher growth rate compared with those fed control diet （P＜0.05）. However, no significant differences in growth were observed between single probiotic groups and the control group. Diet with supplementation of probiotics could improve the protease、lipase and amylase activities in digest tract of turbot, that is, the activities of protease was significantly higher in turbots fed the compound probitics （P＜0.05） than those in turbots fed control diet. The present results indicate that the diet with supplementation of probiotics can improve growth and digestive enzyme activities, and that compound probiotics groups show better effects than single probiotics groups.

（本文編輯:譚雪靜）

Effects of dietary probiotics on growth and digestive enzyme activities of juvenileScophthal musmaximus

GAO Feng-xiang, GUO Wen, PAN Lei, HU Fa-wen, JIAN Yu-xia, ZHANG Shao-chun, WANG Xue
（Mariculture Institute of Shandong Province, Qingdao 266071, China）

S963.21+1

A

1000-3096（2011）01-0010-07

2010-01-15;

2010-06-06

國家海洋局公益性專項項目（200705023）

高鳳祥（1981-）, 男, 山東青島人, 碩士, 主要從事海洋生物學(xué)研究, 電話: 0532-86513001, E-mail: ouqdgf@gmail.com