鄧 瑋，陳慶偉，李興升，李桂瓊，柯大智，莫顯剛

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院老年病科，重慶 400010)

小鼠心肌纖維化模型的制備及其膠原沉積的機制

鄧 瑋，陳慶偉，李興升，李桂瓊，柯大智，莫顯剛

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院老年病科，重慶 400010)

目的 建立缺血性心肌纖維化小鼠模型并探討其膠原沉積機制。方法 將BALB/c小鼠隨機分為實驗組和對照組，每組10只。實驗組予以腹部皮下注射異丙腎上腺素50 mg/kg，每天2次，連續(xù)10 d。對照組同法注射生理鹽水。對比體表心電圖，45 d后處死小鼠，天狼猩紅染色觀察心臟I、III型膠原纖維含量，熒光定量PCR檢測心臟基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)基因表達，免疫組化染色分析心、肝、腎組織層粘連蛋白(LN)的表達。結(jié)果 實驗組小鼠室性心律失常增多，心率加快(P＜0.05);心臟膠原沉積較多，MMP-9、TIMP-1、LN表達上調(diào)(P＜0.05)，肝、腎組織 LN無明顯改變(P＞0.05)。結(jié)論 異丙腎上腺素能制備缺血性心肌纖維化小鼠模型，其機制與MMP-TIMP失衡有關(guān)。

異丙腎上腺素;心肌纖維化;小鼠;動物模型

動物模型的穩(wěn)定性、高仿性和易操作性是心血管疾病研究的首要考慮因素。建立一種簡便易行的心肌纖維化動物模型，對于研究心肌纖維化病理生理進程及干預(yù)治療有著重要的意義。異丙腎上腺素造模方法接近疾病進程，且相對無創(chuàng)、動物死亡率低，但目前文獻報道的注射劑量不一，尚無心臟膠原沉積及其病理機制報道。本實驗采用異丙腎上腺素腹部皮下注射法制備缺血性心肌纖維化小鼠模型，觀察心臟膠原纖維沉積，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物

BALB/c雌性SPF級小鼠20只，體重18～20 g，約6周齡，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心【SCXK(渝)2007-0001】提供。按照實驗動物使用的3R原則，實驗處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 藥物

異丙腎上腺素注射液：造模藥物，上海禾豐制藥有限公司生產(chǎn)。批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字 H31021344。生產(chǎn)批號：080701。規(guī)格：每支1 mg/2 mL。

1.3 模型制作

20只BALB/c雌性小鼠，隨機分為實驗組和對照組，每組10只。實驗組小鼠腹部皮下注射異丙腎上腺素50 mg/kg，每天2次(間隔 12h)，連續(xù)10 d。對照組同法注射生理鹽水。

1.4 體表心電圖對比心率及心律

異丙腎上腺素注射后，麻醉小鼠，行體表心電圖分析。采用Nihon Kohden ECG-6511單道心電圖機(上海光電)接上肢體導(dǎo)聯(lián)，記錄 II導(dǎo)聯(lián)心電圖，分析心率及心律變化。

1.5 苦味酸-天狼猩紅染色分析心臟膠原纖維含量

兩組小鼠常規(guī)飼養(yǎng)45 d。頸椎脫臼法處死小鼠。取左心室橫斷面中部約2 mm厚的組織制成連續(xù)石蠟切片，厚度5 μm，并進行苦味酸-天狼猩紅染色［1］。Image-Pro Plus圖像分析軟件(Media Cybernetics公司，美國)行定量分析。

1.6 實時熒光定量PCR分析心臟MMP-9、TIMP-1表達

摘取心臟，取心尖組織行實時熒光定量 PCR。Trizol一步法提取總 RNA，紫外分光光度計驗證其純度。常規(guī)方法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

根據(jù)GeneBank設(shè)計特異性引物。MMP-9引物(序列為：F 5′-CACAGCCAACTATGACCAGGAT-3′，R 5′-GCTGCCACCAGGAACAGG-3′)，TIMP-1 引物(序 列 為：F 5′-CCCCAGAAATCAACGAGACC-3′，R 5′-CGCCAGGGAACCAAGAAG-3′) 和 β-actin 引 物(序列為 F 5′-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3′，R 5′-ATGTCACGCACGATTTCCC-3′)由上海閃晶生物科技有限公司合成。

使用FTC2000(Canada)熒光定量PCR儀進行擴增反應(yīng)。采用SYBR Green熒光定量PCR試劑盒(上海閃晶)分別對目的基因進行定量檢測。每反應(yīng)體系包括 cDNA 1μL，2 ×PCR buffer 25 μL，目的基因引物對(25 pmol/μL)0.6 μL × 2，無 RNase水 22.5 μL，Sybr green I(20 ×)0.3 μL 等; 經(jīng)94℃4 min;94℃ 20 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s 循環(huán) 35 次，72℃檢測信號。同時檢測 β-actin表達水平作為內(nèi)參照，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線、擴增曲線及熔解曲線，并讀取循環(huán)閾值 (cycle threshold)，采用相對比值法進行計算。

1.7 免疫組化分析心臟LN的表達

心、肝、腎組織按常規(guī)方法行切片免疫組化染色。按過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素染色試劑盒(北京中杉金橋)、LN抗體(北京博奧森)說明書操作，陰性對照以PBS液代替一抗。顯微鏡觀察 LN的陽性著色部位及數(shù)量，Image-Pro Plus圖像分析軟件(Media Cybernetics公司，美國)行定量分析。LN陽性表達量以陽性表達物的平均吸光度值(average integrated optical density)(取10個視野的平均值)來表示。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，組間比較采用成組t檢驗，P＜0.05為統(tǒng)計有顯著意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠心率及心律比較

對照組小鼠心率為每分鐘(599.20±22.48)次，實驗組小鼠心率加快，為每分鐘(720.50±34.71)次，實驗組與對照組相比，差異有顯著性(P＜0.05)。實驗組小鼠室性心律失常明顯增加，可見室性早搏、室性顫動等(圖1)，偶見房室傳導(dǎo)阻滯。

2.2 心肌膠原纖維分布

在普通光鏡下，Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維呈紅色，心肌細胞呈黃色(圖2-A)。在偏振光顯微鏡下，I型膠原纖維呈明亮的橙紅色或明黃色;III型膠原纖維呈綠色。圖像定量分析結(jié)果(圖2-B)顯示，實驗組的膠原纖維沉積較多，對照組的膠原纖維含量較少(P＜0.05)。圖2見彩插4。

2.3 心肌 MMP-9、TIMP-1 mRNA表達

實時熒光定量PCR結(jié)果顯示：與對照組相比，實驗組心肌的 MMP-9和 TIMP-1表達明顯增高(P＜0.05)，見圖 3。

圖1 兩組小鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖比較Fig.1 LeadⅡelectrocardiogram tracings recorded from the mice

圖3 兩組心肌 MMP-9、TIMP-1 mRNA表達Fig.3 Expression of MMP-9 and TIMP-1 mRNA in the myocardium of mice from each group

2.4 各組心、肝、腎LN的表達

與對照組相比，實驗組心肌LN表達較多(P＜0.05)，主要表達于膠原纖維沉積區(qū)和心肌細胞邊緣，見圖4。兩組小鼠肝(圖5)、腎(圖6)組織的LN表達差異無顯著性(P＞0.05)。圖4～6見彩插4。

3 討論

隨著心血管疾病及治療研究的不斷深入，穩(wěn)定高仿的缺血性心肌纖維化動物模型是實驗成功的基礎(chǔ)。結(jié)扎冠脈［2］、縮窄腹主動脈、夾閉腎動脈等方法均為開放性手術(shù)造模，創(chuàng)傷大，對動物模型后續(xù)的基因或干細胞治療不利。為探尋接近心肌纖維化病理進程的小鼠模型，我們開展了此項研究。

本實驗通過前期預(yù)實驗和本研究發(fā)現(xiàn)，異丙腎上腺素50 mg/kg行腹部皮下注射，每天2次，連續(xù)10d，能制成明顯的心肌纖維化小鼠模型。此缺血性心肌纖維化小鼠模型心率加快，室性心律失常增加，心臟Ⅰ、Ⅲ型膠原大量沉積，LN增多，其機制與MMP-TIMP表達失衡有關(guān)。

異丙腎上腺素是β受體激動劑，作用于心臟β1受體，使心收縮力增強，心率加快，心輸出量和心肌耗氧量增加。我們參考了異丙腎上腺素制模的相關(guān)文獻［3-5］，并在預(yù)實驗中摸索了注射劑量、間隔時間及給藥時程，發(fā)現(xiàn)50 mg/kg行腹部皮下注射，每天2次，連續(xù)10天是小鼠不致死又快速損傷心肌的較好方法。

心肌纖維化的本質(zhì)是心臟細胞外基質(zhì)重塑。細胞外基質(zhì)最主要的成分是Ⅰ、Ⅲ型膠原，此外，LN、彈性蛋白等也參與其中［6］。研究結(jié)果顯示，實驗組心臟膠原纖維增生、LN較多，證明缺血性心肌纖維化造模成功。異丙腎上腺素注射后，小鼠心肌耗氧量持續(xù)增加，通過血流動力學(xué)效應(yīng)［7］和神經(jīng)體液因素［8］影響，心臟基質(zhì)重塑的關(guān)鍵酶 MMP及 TIMP表達失衡，是造成心臟Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維增生的主要原因［9，10］。本研究中，實驗組心臟 MMP-9和 TIMP-1表達明顯上調(diào)，提示異丙腎上腺素注射可導(dǎo)致心臟MMP-TIMP系統(tǒng)紊亂。MMP-TIMP與心臟膠原沉積有著密切關(guān)系。MMP-TIMP表達紊亂直接導(dǎo)致膠原纖維合成增多、降解減少［11，12］。

MMP-TIMP 上調(diào)還影響 LN 表達增多［13，14］。實驗組的心臟間質(zhì) LN表達增多，而肝、腎組織LN表達無明顯改變，提示異丙腎上腺素注射能特異性地損傷心肌。

本缺血性心肌纖維化小鼠模型的優(yōu)越性在于：不進行開腹、開胸手術(shù)，降低了動物死亡率;制模方法簡單，符合缺血性心肌損傷的病理進程，是心血管動物實驗的較理想動物模型。

(本文圖 2，4 ～6 見彩插 4。)

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Establishment of a mouse model of myocardial fibrosis with isoproterenol and the mechanism of collagen deposition

DENG Wei，CHEN Qing-wei，LI Xing-sheng，LI Gui-qiong，KE Da-zhi，MO Xian-gang
(Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400010，China)

Objective To establish a manipulation-easy animal model of post-ischemic myocardial fibrosis and investigate the mechanism of collagen deposition.Methods Twenty BALB/c mice were randomly divided into two groups：the experimental group and control group.The mice in the experimental group were subjected to hypodermic injection with isoproterenol in a dose of 50 mg/kg.The injection was carried out twice a day for consecutive 10 days.Physiological saline was injected with the same method in the control group.The surface electrocardiogram was measured.Forty-five days after injection，collagen distribution was observed using sirius red staining.Expression levels of matrix metalloproteinase-9(MMP-9)And tissue inhibitor of metalloproteinase-1(TIMP-1)in myocardium were detected by fluorescent qRT-PCR.The expression of laminin(LN)in the heart，liver and kidney was detected by immunohistochemistry.Results The experimental group had increased ventricular arrhythmia and faster heart rate，and had increased levels of MMP-9，TIMP-1，LN and collagen deposition in the myocardium than those in the control group(P＜0.05).The expression of LN in the liver and kidney showed no significant difference(P＞0.05).Conclusions Isoproterenol-induced collagen deposition in the experiment is a reproducible，handy and credible method to establish an animal model of myocardial fibrosis.MMP-TIMP imbalance is involved in the mechanism.

Isoproterenol;Myocardial fibrosis;Mouse;Animal model

Q95-33，R542.23

A

1005-4847(2011)02-0103-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.02.004

心肌纖維化模型在心血管動物實驗中有著重要的作用。目前，致實驗動物心肌纖維化的方法有：①自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)心肌纖維化;②糖尿病大鼠心肌纖維化;③二腎一夾(2K1C)及腎下主動脈縮窄(INAC)模型心肌纖維化;④腹主動脈狹窄所致充血性心力衰竭大鼠心肌纖維化;⑤冠脈結(jié)扎法、微創(chuàng)法、介入法和冷凍法等引起心肌梗死心肌纖維化;⑥異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌缺血損傷心肌纖維化。

國家自然科學(xué)基金項目(編號：30970826)。

鄧瑋(1978-)，女，主治醫(yī)師，博士生，研究方向：心肌纖維化

陳慶偉，Email：chenqwcq@yahoo.com.cn

2010-10-20