陳茂功，林小虎，李洪杰，王曉鳴* ，周印富*

(1河北科技師范學(xué)院生命科技學(xué)院，河北秦皇島，066004;2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所)

由新月彎孢(Curvularia lunata(Wakker)Boed)引起的玉米彎孢葉斑病已成為一種重要的葉部病害，對我國玉米生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的損失，一般會促使玉米減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重為害時(shí)減產(chǎn)50%以上，甚至絕收［1～4］。目前對該病害研究主要集中在抗病品種與變異和致病機(jī)理等方面［5，6］，但對該病菌在玉米葉片上的侵染及發(fā)育過程仍不十分清楚。

GFP基因作為一種活體報(bào)告基因，其應(yīng)用已深入到植物病害研究中的各個(gè)方面，如對植物病原體的侵染、致病機(jī)理的研究［7，8］。本研究擬建立一套農(nóng)桿菌介導(dǎo)彎孢菌的轉(zhuǎn)化方法，同時(shí)將GFP基因轉(zhuǎn)入到彎孢葉斑病菌中，獲得該菌轉(zhuǎn)化子，以便進(jìn)行侵入機(jī)理研究。

1 材料和方法

1．1 菌株

玉米彎孢葉斑病菌(C．lunata)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所檢疫基地保存;農(nóng)桿菌菌株為AGL-1，質(zhì)粒以pCAMBIAI300為骨架構(gòu)建了pCAMDGFP［9］，并含有潮霉素B(HyB)和卡那霉素(kan)抗性，由 Marina Franceschetti(john inner Center，UK)惠贈。

1．2 主要試劑

潮霉素B、頭孢噻肟鈉、卡那霉素、乙酰丁香酮、MES購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司;其他所用試劑均購于北京萬鑫化業(yè)商貿(mào)中心。

1．3 方法

1．3．1 頭孢噻肟鈉對農(nóng)桿菌抑菌濃度的測定 將農(nóng)桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖培至OD600約為0．6后，取100 μL分別涂于含有頭孢噻肟鈉 (0，50，100，150，200 mg/L)的 PDA 培養(yǎng)基上，每個(gè)濃度3次重復(fù)，25℃下培養(yǎng)4 d后觀察農(nóng)桿菌菌落的生長情況，確定頭孢噻肟鈉的抑菌濃度。

1．3．2 潮霉素B對彎孢菌菌落生長的抑制測定 在含不同質(zhì)量濃度潮霉素B(0，30，50，75，100，150 mg/L)的PDA培養(yǎng)基上，接種直徑4 mm的菌餅，每個(gè)濃度3次重復(fù)，25℃下培養(yǎng)6 d，每隔36 h測量1次菌落直徑，觀察潮霉素B對菌落生長的抑制。

1．3．3 潮霉素B對彎孢菌分生孢子萌發(fā)的抑制測定 取100 μL的分生孢子懸濁液(109個(gè)/L)分別涂于含有潮霉素 B(0，30，50，75，100，150 mg/L)的 PDA 培養(yǎng)基上，每個(gè)濃度3次重復(fù)，25 ℃下培養(yǎng)48 h，觀察潮霉素B對分生孢子萌發(fā)的抑制。

1．3．4 不同轉(zhuǎn)化條件對彎孢菌ATMT轉(zhuǎn)化效率的影響 轉(zhuǎn)化方法參照趙培寶等的方法進(jìn)行［10］，并稍作修改。取誘導(dǎo)后的農(nóng)桿菌菌液與萌發(fā)彎孢葉斑病菌分生孢子懸浮液等體積混合，均勻涂布于IM固體培養(yǎng)基的微孔濾膜上，黑暗培養(yǎng)一定時(shí)間后將濾膜轉(zhuǎn)移到含有200 mg/L的頭孢噻肟鈉和50 mg/L潮霉素的PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7 d后將生長出來的菌落轉(zhuǎn)移到含有50 mg/L潮霉素的PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行二次篩選。

①孢子萌發(fā)時(shí)間。采用萌發(fā)0，6，12，24 h的分生孢子分別進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，其它操作同上。

②共培養(yǎng)介質(zhì)。分別覆有玻璃紙、微孔濾膜、定性濾紙的共培養(yǎng)基進(jìn)行共培養(yǎng)，其它操作同上。③共培養(yǎng)溫度和時(shí)間。分別設(shè)置共培養(yǎng)溫度20，23，25，28℃，培養(yǎng)24，48，72 h，其它操作同上。

④受體材料。參照王賡等的方法制備彎孢菌原生質(zhì)體［11］。分別采用孢子懸浮液、菌絲、原生質(zhì)體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，其它操作同上。以上試驗(yàn)均設(shè)置3次重復(fù)。

1．3．5 轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定性分析 用單孢分離的方法獲得轉(zhuǎn)化子，隨機(jī)選擇10個(gè)轉(zhuǎn)化子分別在含有50 mg/L潮霉素和不含有潮霉素的PDA平板上連續(xù)傳代5代，然后接種于含有50 mg/L潮霉素的平板上，觀察轉(zhuǎn)化子是否生長及性狀是否穩(wěn)定。

1．3．6 轉(zhuǎn)化子的PCR檢測和熒光觀察 隨機(jī)挑取遺傳穩(wěn)定的10個(gè)轉(zhuǎn)化子菌落，以野生型彎孢菌為對照，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后收集菌絲體。分別提取基因組DNA后進(jìn)行g(shù)fp基因和潮霉素B抗性基因的 PCR檢測，程序?yàn)?95℃預(yù)變性10 min;95℃變性30 s，56℃復(fù)性30 s，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min;經(jīng)10 g/L瓊脂糖電泳檢測。挑取轉(zhuǎn)化子的菌絲制成玻片，在Olympus熒光顯微鏡下進(jìn)行熒光觀察，同時(shí)以野生型菌株為對照。

1．3．7 轉(zhuǎn)化子致病性的測定 感病自交系黃早四長至四葉期，以接種液(蔗糖:20 g/L;Tween 20:0．2 g/L;無菌水)調(diào)節(jié)病菌分生孢子濃度至1．0×109個(gè)/L，用高壓噴霧裝置噴霧接種。實(shí)驗(yàn)選取5個(gè)轉(zhuǎn)化子，設(shè)置陰性對照(無菌接種液)及陽性對照(野生型菌株孢子懸液)。接種處理后黑暗保濕48 h。每天觀察植株發(fā)病情況并記錄。

2 結(jié)果和分析

2．1 頭孢噻肟鈉對農(nóng)桿菌抑菌濃度的測定

農(nóng)桿菌菌液涂于含有不同濃度的頭孢噻肟鈉的PDA培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)4 d后，在頭孢噻肟鈉質(zhì)量濃度為0，50，100 mg/L的處理中均出現(xiàn)菌落，其他濃度無菌落出現(xiàn)。當(dāng)頭孢噻肟鈉為150 mg/L時(shí)，在短時(shí)間內(nèi)可抑制農(nóng)桿菌的生長。但考慮彎孢菌ATMT的轉(zhuǎn)化周期及細(xì)菌生長特性，本次試驗(yàn)選用比臨界濃度稍高的抗生素濃度，確定頭孢噻肟鈉質(zhì)量濃度為200 mg/L作為病菌ATMT轉(zhuǎn)化時(shí)農(nóng)桿菌抑菌濃度。

圖1 不同濃度潮霉素B對于菌落生長的抑制影響

2．2 潮霉素B最適濃度的選擇

潮霉素B可以有效地抑制真菌分生孢子的萌發(fā)。將彎孢菌的分生孢子接種于5種不同的潮霉素濃度的PDA培養(yǎng)基中25℃連續(xù)培養(yǎng)2 d。當(dāng)潮霉素質(zhì)量濃度達(dá)到50 mg/L以上時(shí)，分生孢子萌發(fā)受到完全抑制。將直徑4 mm的彎孢菌落接種于不同的潮霉素B濃度的PDA培養(yǎng)基中，25℃下連續(xù)培養(yǎng)6 d。當(dāng)質(zhì)量濃度到達(dá)50 mg/L時(shí)，菌落的生長受到了完全的抑制。本試驗(yàn)確定以50 mg/L作為篩選轉(zhuǎn)化子的有效濃度(圖1)。

2．3 分生孢子萌發(fā)時(shí)間對轉(zhuǎn)化效率的影響

采用不同萌發(fā)程度的分生孢子進(jìn)行轉(zhuǎn)化。利用未萌發(fā)的分生孢子進(jìn)行轉(zhuǎn)化得到32個(gè)轉(zhuǎn)化子;利用萌發(fā)6 h的孢子轉(zhuǎn)化得到67個(gè)轉(zhuǎn)化子;利用萌發(fā)12 h的孢子得到106個(gè)轉(zhuǎn)化子，利用萌發(fā)24 h的孢子得到71個(gè)轉(zhuǎn)化子。萌發(fā)12 h的孢子的轉(zhuǎn)化效率是最高的，說明萌發(fā)的孢子有利于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，萌發(fā)12 h的孢子是農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的最佳材料(圖2)。

2．4 共培養(yǎng)介質(zhì)對轉(zhuǎn)化效率的影響

在定性濾紙上進(jìn)行共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化效率為55個(gè)轉(zhuǎn)化子/106個(gè)孢子，顯著低于在微孔濾膜和玻璃紙;微孔濾膜的轉(zhuǎn)化效率(108個(gè)轉(zhuǎn)化子/106個(gè)孢子)高于玻璃紙的轉(zhuǎn)化效率(98個(gè)轉(zhuǎn)化子/106個(gè)孢子)(圖3)。

圖2 孢子萌發(fā)時(shí)間對轉(zhuǎn)化效率的影響

圖3 介質(zhì)類型對轉(zhuǎn)化效率的影響

2．5 共培養(yǎng)溫度和時(shí)間對轉(zhuǎn)化效率的影響

當(dāng)共培養(yǎng)溫度為19℃和28℃時(shí)，轉(zhuǎn)化效率較低。在共培養(yǎng)時(shí)間為24 h時(shí)，在19，23，25，28℃分別得到了43，64，78，58個(gè)轉(zhuǎn)化子;在共培養(yǎng)時(shí)間為48 h時(shí)，分別得到58，89，106，78個(gè)轉(zhuǎn)化子;在共培養(yǎng)時(shí)間為72 h時(shí)，分別得到47，79，67，43個(gè)轉(zhuǎn)化子。結(jié)果表明，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化最佳條件為共培養(yǎng)溫度25℃，共培養(yǎng)時(shí)間48 h(圖4)。

圖4 共培養(yǎng)時(shí)間和溫度對轉(zhuǎn)化效率的影響

圖5 受體材料對轉(zhuǎn)化效率的影響

2．6 受體材料對轉(zhuǎn)化效率的影響

以萌發(fā)的分生孢子為受體材料進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)108個(gè)轉(zhuǎn)化子/106個(gè)孢子，顯著高于以原生質(zhì)體為受體的轉(zhuǎn)化效率(65個(gè)轉(zhuǎn)化子/106個(gè)原生質(zhì)體)，而以菌絲為受體材料得到的轉(zhuǎn)化子為0(圖5)。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率低可能是彎孢菌原生質(zhì)體不易制備，且數(shù)量較少;菌絲轉(zhuǎn)化為0可能是彎孢菌菌絲細(xì)胞壁太厚，農(nóng)桿菌不易侵染，不能作為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的受體材料。

2．7 彎孢菌轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定性分析

隨機(jī)選擇的10個(gè)轉(zhuǎn)化子，在PDA和含50 mg/L潮霉素的PDA上分別轉(zhuǎn)代5次后轉(zhuǎn)接到含50 mg/L潮霉素的PDA觀察菌落生長。結(jié)果表明:轉(zhuǎn)代后轉(zhuǎn)化子都能在含潮霉素B的培養(yǎng)基上生長，且菌落形態(tài)正常，表明轉(zhuǎn)化子在遺傳上是穩(wěn)定的。

圖6 彎孢菌轉(zhuǎn)化子中g(shù)fp基因、潮霉素B抗性基因的PCR擴(kuò)增A為潮霉素B抗性基因擴(kuò)增產(chǎn)物;B為gfp基因擴(kuò)增產(chǎn)物;M為標(biāo)準(zhǔn)分子量;1～10為轉(zhuǎn)化子的擴(kuò)增產(chǎn)物;11為野生型對照

2．8 彎孢菌轉(zhuǎn)化子的PCR檢測

以彎孢菌轉(zhuǎn)化子和野生菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果10個(gè)轉(zhuǎn)化子均擴(kuò)增出gfp基因和潮霉素B抗性基因，而野生菌株則沒有任何擴(kuò)增產(chǎn)物(圖6)。

2．9 彎孢菌轉(zhuǎn)化子的熒光觀察

挑取轉(zhuǎn)化子G1和野生菌株的菌絲在488 nm波長下進(jìn)行熒光觀察，結(jié)果野生菌株沒有觀察到任何熒光，轉(zhuǎn)化子的菌絲和分生孢子均能發(fā)出綠色熒光(圖7)。

圖7 綠色熒光蛋白在彎孢菌轉(zhuǎn)化子中不同時(shí)期的表達(dá)

2．10 轉(zhuǎn)化子致病性的測定

接種實(shí)驗(yàn)結(jié)果，野生型菌株、轉(zhuǎn)化子1和轉(zhuǎn)化子2表現(xiàn)出較強(qiáng)的毒性和侵染力，在接種后第3天，寄主植物黃早四即開始產(chǎn)生典型病斑，第4天癥狀明顯加重，第5天病害級別即達(dá)到3級～4級;轉(zhuǎn)化子3和轉(zhuǎn)化子4也可以在寄主植物上引起典型病斑，但是菌株侵襲力和致病力較弱，分別在第4天、第5天開始出現(xiàn)癥狀且發(fā)病輕，第5天病害級別為1級～2級;轉(zhuǎn)化子5則致病力完全喪失(圖8)。

圖8 玉米孢子懸濁液噴霧接種結(jié)果

3 討 論

農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化是農(nóng)桿菌與真菌相互作用的結(jié)果，凡能影響真菌轉(zhuǎn)化、農(nóng)桿菌侵染以及轉(zhuǎn)化子再生的各種因素都會影響其轉(zhuǎn)化效率。因此，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的提高依賴于對各種影響因子的優(yōu)化和轉(zhuǎn)化條件的改善［12，13］。

不同真菌使用抗生素的濃度不同。完全抑制木霉生長的潮霉素B最低質(zhì)量濃度為150 mg/L，完全抑制玉米大斑病菌的潮霉素B為100 mg/L。本研究中抑制彎孢菌生長的潮霉素B質(zhì)量濃度為50 mg/L，相對于已報(bào)道的真菌抑制生長潮霉素B濃度是比較低的［14，15］。

受體材料是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟。原生質(zhì)體、分生孢子、菌絲乃至蘑菇子實(shí)體均可作為受體材料，某些真菌以原生質(zhì)體或分生孢子為受體材料均可成功轉(zhuǎn)化，而有些真菌轉(zhuǎn)化只能以原生質(zhì)體作為受體材料［16～21］。本研究表明，以萌發(fā)12 h的分生孢子為受體材料，轉(zhuǎn)化效率高。萌發(fā)時(shí)間過短或過長都會降低轉(zhuǎn)化效率，這可能由于彎孢葉斑病菌分生孢子壁較厚，而萌發(fā)的芽管在一定時(shí)間內(nèi)管壁較薄，農(nóng)桿菌易侵染;萌發(fā)時(shí)間過長，管壁增厚，使農(nóng)桿菌不易侵染所致。

共培養(yǎng)條件也是影響轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵，包括共培養(yǎng)時(shí)間及溫度、共培養(yǎng)介質(zhì)等。共培養(yǎng)時(shí)間的增加會提高轉(zhuǎn)化效率，但時(shí)間過長會導(dǎo)致T-DNA插入的拷貝數(shù)增加;時(shí)間過短，農(nóng)桿菌侵染受體材料尚未完成［22］。過高的轉(zhuǎn)化溫度會使農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化功能喪失，即T-DNA插入宿主能力的丟失，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率降低;過低的溫度會導(dǎo)致各種菌體活性降低［22］。對于彎孢葉斑病菌而言，在25℃黑暗條件下共培養(yǎng)48 h轉(zhuǎn)化效率最高。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，以微孔濾膜為介質(zhì)轉(zhuǎn)化效率最高，可能由于微孔濾膜有較好的通透性，使彎孢葉斑病菌分生孢子與農(nóng)桿菌均獲得充足營養(yǎng)。

本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，成功將綠色熒光蛋白標(biāo)記基因插入到彎孢葉斑病菌的基因組DNA中，獲得了gfp穩(wěn)定遺傳的彎孢葉斑病菌突變株，為研究該病原菌的侵染循環(huán)和致病機(jī)制提供了基礎(chǔ)性研究材料。通過本研究建立的彎孢菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)還可以用來進(jìn)行其功能基因的研究。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化以T-DNA隨機(jī)插入受體菌基因組中，從而可能導(dǎo)致相應(yīng)功能的喪失或減弱，進(jìn)而根據(jù)表型變化來研究該基因的功能，為開展玉米彎孢葉斑病菌基因功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

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