王 媛，王 坦，王 玉，楊廷桐

研究表明乳腺癌的發(fā)生是基因調(diào)控失衡的結(jié)果，其生物學(xué)特性與多種癌基因的作用密切相關(guān)，TGF-β1有促進(jìn)腫瘤侵襲，轉(zhuǎn)移，上皮間葉轉(zhuǎn)化（EMT）[1]，血管增生以及免疫抑制等多種作用。野生型p53（wt-p53)具有顯著地腫瘤抑制作用，而突變型p53（mp-53）則具有致癌的作用。目前有關(guān)TGF-β1，wt-p53在乳腺癌的研究中極少報(bào)道。本研究運(yùn)用血清學(xué)和免疫印跡技術(shù)分別檢測(cè)了TGF-β1，wt-p53基因在乳腺癌組織中的表達(dá)，并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 2010-03～2011-04筆者所在醫(yī)院手術(shù)切除的標(biāo)本，選取資料完整、病理組織學(xué)確診的乳腺癌48例，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的31例，年齡31～62歲。并選取正常乳腺組織和癌旁組織作為對(duì)照。

1.1.2 主要試劑 兔抗人TGF-β1，p53多克隆一抗，羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，TGF-β1分子量為23 kD，wp-53分子量為53 kD，β-actin分子量為42 kD。均購自武漢博士德生物工程有限公司，顯色劑購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。ELISA檢測(cè)試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司。

1.2 方法 受試者抽取清晨空腹外周靜脈血3 ml，-4℃冰箱保存待檢測(cè)。采用ELISA法分別檢測(cè)TGF-β1，p53含量，嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.2.1 組織中總蛋白提取及電泳 將液氮低溫保存的乳腺組織，腺癌及癌旁組織剪碎后各取100 mg，分別加入500 μl蛋白裂解液，4℃，15 000 r/min 勻漿后，2000 r/離心 15 min，上清移入另一管中，20 000 r/離心15 min，棄上清，取沉淀重新懸浮于200 μl勻漿緩沖液中，加蛋白提取液，充分混勻，沸水加熱變性10 min，應(yīng)用蛋白分析試劑測(cè)定蛋白濃度。向加樣槽中加入各個(gè)樣品及蛋白標(biāo)志物各25 μl，電壓75 V，電泳30 min。電泳完畢后取出凝膠，用電轉(zhuǎn)膜儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，加封閉液封閉，室溫加第一抗體，二抗，顯色。

1.2.2 半定量結(jié)果分析 利用天能圖像分析系統(tǒng)對(duì)顯色結(jié)果拍照，記錄電泳條帶凈光密度和強(qiáng)度值，以目的基因與內(nèi)參比值確定其含量計(jì)算其表達(dá)的相對(duì)豐度。

2 結(jié) 果

2.1 血液中TGF-β1，p53在正常人和乳腺癌患者中的含量比較 見表1。

表1 不同人血液中 TGF-β1，wt-p53 含量（±s，μg/L）

表1 不同人血液中 TGF-β1，wt-p53 含量（±s，μg/L）

正常人與乳腺癌患者相比，P<0.01

組別 n TGF-β1 wt-p53正常人 15 6.46±0.31 6.84±0.24乳腺癌患者 48 12.58±0.22 3.23±0.11Ⅰ～Ⅱ期 31 11.17±0.25 3.81±0.34Ⅲ～Ⅳ期 17 13.36±0.31 2.43±0.27

2.2 免疫印跡結(jié)果 TGF-β1在相對(duì)分子量23 kD處；wtp53在相對(duì)分子量53 kD處；β-actin在相對(duì)分子量 42 kD處；分別出現(xiàn)特異性條帶（圖1）。電泳條帶光密度值計(jì)算：目的基因/β-actin.正常腺體，炎癥和癌旁組織的 TGF-β1、wtp53表達(dá)無顯著性差異 （P>0105）；乳腺癌組織中TGF-β1、wt-p53表達(dá)與正常乳腺組織和癌旁組織相比有顯著性差異（P<0.01）；已有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 TGF-β1、p53 表達(dá)與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者相比有顯著差異（P<0.01）。見圖1，表2。

圖1 Western免疫印跡TGF-β1，p53表達(dá)

3 討 論

TGF-β1具有腫瘤抑制基因和癌基因的雙重角色，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的異常與腫瘤的發(fā)生、腫瘤細(xì)胞的浸潤及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]，TGF-β1在腫瘤的發(fā)生過程中激活上皮細(xì)胞周圍基質(zhì)，形成腫瘤相關(guān)基質(zhì)，對(duì)具有促癌作用的基質(zhì)環(huán)境的形成起著關(guān)鍵作用，并誘導(dǎo)促進(jìn)上皮細(xì)胞向間葉轉(zhuǎn)化，使上皮細(xì)胞更具有活動(dòng)能力，在細(xì)胞基質(zhì)間自由移動(dòng)極富有侵襲性[3]。近年國外研究顯示在胃癌，結(jié)直腸癌等腫瘤中發(fā)揮重要作用[4]。

表2 不同組織中TGF-β1、wt-p53蛋白產(chǎn)物光密度比值（±s）

表2 不同組織中TGF-β1、wt-p53蛋白產(chǎn)物光密度比值（±s）

正常與癌旁比較P>0.05；正常與癌組織和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相比P<0.01；有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相比P<0.01

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本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)無論是在血清中還是在組織中TGF-β1的含量乳腺癌患者和乳腺癌組織中均比正常人和正常乳腺組織顯著增高，而且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者表達(dá)更高，推測(cè)TGF-β1的高表達(dá)與乳腺癌的發(fā)展相關(guān)，與乳腺癌更具有侵襲能力的生物學(xué)行為相關(guān)。TGF-β1可誘導(dǎo)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞向間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT），增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力侵襲能力[5]。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是多基因參與多步驟完成的復(fù)雜病理過程，但腫瘤細(xì)胞粘附能力減弱和運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)是其轉(zhuǎn)移的首要條件和基礎(chǔ)。Yao等[6]在對(duì)卵巢癌細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn)TGF-β1參與卵巢癌細(xì)胞的上皮-纖維原細(xì)胞-成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)變過程中 使其逐漸獲得了遷移特性。

p53基因（Wt-p53）定位于17q13.1上，編碼由393個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)p53蛋白，是一種抑癌基因，細(xì)胞凋亡過程被認(rèn)為有賴于Wt-p53基因的存在[7]。Wt-p53則通過調(diào)節(jié)bcl-2，Caspase，Bax等基因表達(dá)，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡控制程序，在50%的腫瘤細(xì)胞中存在p53突變，是基因改變頻率最高的目標(biāo)基因。Wt-p53基因發(fā)生突變時(shí)可產(chǎn)生突變型p53蛋白 （mt-p53），mt-p53可抑制Wt-p53活性或使之失活，而且p53突變體失去了誘導(dǎo)凋亡的功能從而引起細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和癌變[8]。mt-p53起著原癌基因的作用穩(wěn)定存在并在腫瘤細(xì)胞核內(nèi)積累而引起細(xì)胞惡性增殖[9]，抑制細(xì)胞凋亡并促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。在肺癌卵巢癌等組織中p53以突變型為主，子宮頸癌組中以Wt-p53為主，且表達(dá)顯著降低。Wt-p53半衰期短易失活，因此p53失活快是增加患子宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)的原因之一[10]。在本實(shí)驗(yàn)中Wt-p53的表達(dá)隨著乳腺癌的發(fā)展與轉(zhuǎn)移在血液和組織中越來越低。因此Wt-p53得缺失可能是乳腺癌生物學(xué)行為演變的一種發(fā)生機(jī)制，Wt-p53的缺失與乳腺癌進(jìn)展相關(guān)。這一結(jié)論與Qian等在對(duì)前列腺癌的研究中所得的結(jié)論相符[11]。

本研究從血清學(xué)和免疫印跡的角度探討了TGF-β1，Wt-p53與乳腺癌發(fā)展轉(zhuǎn)移的關(guān)系。證明了TGF-β1升高和Wt-p53降低是乳腺癌發(fā)生，侵襲轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)信號(hào)，可作為乳腺癌生物學(xué)行為和預(yù)后判斷的潛在指標(biāo)。也可成為乳腺癌復(fù)發(fā)的血清學(xué)指標(biāo)。以后注重在乳腺癌中TGF-β1調(diào)控機(jī)制和通路方面的研究。

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