宋永康 ，黃 薇，姚清華，陳麗華，劉文靜，李玥仁福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室;福建省精密儀器農(nóng)業(yè)測(cè)試重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350003

水稻是我國(guó)重要的糧食作物，稻瘟病、紋枯病等真菌病害，是水稻生產(chǎn)的主要限制因素之一。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將外源抗病基因?qū)胨?，培育出抗病水稻新品種，是解決這一問題的有效途徑(張志忠等，2005)。幾丁質(zhì)和β-1，3-葡聚糖都是組成真菌細(xì)胞壁的主要碳水化合物，因此，起降解作用的幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶在防御病原真菌侵害中具有重要作用。病原真菌細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)的降解，能夠破壞細(xì)胞新物質(zhì)的沉積，致使病原體死亡，且其產(chǎn)生的細(xì)胞壁碎片具有誘導(dǎo)作用，從而刺激寄主植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)。β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶具有協(xié)同的抗真菌作用(王關(guān)林和方宏筠，2009)。另外，在抗病性研究中發(fā)現(xiàn)，植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)與抗病性有關(guān)，如寄主植物表面蠟質(zhì)層的有無、角質(zhì)層和木栓層的厚薄、硅質(zhì)化的程度等。植物形態(tài)結(jié)構(gòu)的差異可以對(duì)病原菌產(chǎn)生物理上的障礙，或通過誘導(dǎo)植物形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而機(jī)械地阻礙病原菌的侵染(董金皋和黃梧芳，1995)。已有研究表明，水稻秸稈由37%～40%纖維素、27%～30%半纖維素及5%～8%木質(zhì)素緊密交聯(lián)在一起而成，且秸稈纖維素具有較高的結(jié)晶度(彭維和向志明，2007)。而作為秸稈主要成分的纖維素，其含量和結(jié)構(gòu)，在抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻之間是否存在差別，是本研究主要關(guān)注的問題。本文通過化學(xué)法、傅立葉變換紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR)法以及X-射線衍射(X-ray diffractometer，XRD)方法分析了抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻中化學(xué)成分和纖維素結(jié)構(gòu)的變化情況，以期為進(jìn)一步深入地研究轉(zhuǎn)基因水稻的抗病性提供思路。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試水稻為表達(dá)廣譜抗真菌蛋白轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)品1、轉(zhuǎn)品8及非轉(zhuǎn)基因七絲軟粘(對(duì)照)。其中，轉(zhuǎn)品8為雙價(jià)抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻，導(dǎo)入水稻堿性幾丁質(zhì)酶基因(RC24)和苜蓿葡聚糖酶基因(β-1、3-Glu);轉(zhuǎn)品1為三價(jià)抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻，導(dǎo)入水稻堿性幾丁質(zhì)酶基因(RC24、RCH10)以及水稻酸性幾丁質(zhì)酶基因(RAC22)。上述材料均由廣東海洋大學(xué)提供。

供試地點(diǎn)位于福州市閩侯縣良種場(chǎng)，地貌為閩江兩岸丘陵河谷區(qū)，屬南亞熱帶季風(fēng)氣候。試驗(yàn)水田面積約500 m2，為梯田形式，土壤為黃紅壤，土壤總碳含量 16.44 g·kg－1、總氮 1.15 g·kg－1、有效磷33.31 mg·kg－1、速效鉀 68.97 mg·kg－1，pH 5.56，分別種植早、晚兩季轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)品1、轉(zhuǎn)品8及對(duì)照。每個(gè)品種種植3個(gè)小區(qū)。

試驗(yàn)所用秸稈為早稻收割后的轉(zhuǎn)品1、轉(zhuǎn)品8及七絲軟粘的秸稈，采回的樣品葉片、葉鞘和莖分開，在105℃下殺青15 min，然后在80℃烘24 h，粉碎后60目過篩，裝入樣品袋存放于干燥器內(nèi)，待用。

1.2 秸稈的化學(xué)成分分析

采用 Soest et al.(1985、1991)的方法，測(cè)定秸稈的半纖維素、纖維素、木質(zhì)素、硅的總含量，可溶解硅的含量，硅的溶解效率。根據(jù)GB/T 6432－1994(國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局，1994)，測(cè)定秸稈葉片、葉鞘、莖的粗蛋白質(zhì)含量。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3 纖維素的紅外光譜分析

將樣品與適量溴化鉀(光譜純)磨細(xì)混勻并壓片，在傅立葉變換紅外光譜儀(尼高麗360智能型)上進(jìn)行測(cè)定。光譜儀掃描波數(shù)4000～450 cm－1，分辨率為 0.5 cm－1，波數(shù)精度為 0.01 cm－1。根據(jù)測(cè)定得到的紅外光譜圖，按式(1)、(2)計(jì)算紅外結(jié)晶指數(shù)(葉君和熊犍，1999):

式中，A1429、A893、A1372、A2900分別為紅外光譜圖中波數(shù)為 1429、893、1372、2900 cm－1譜帶的吸光度。式(1)、(2)為經(jīng)驗(yàn)公式，沒有明確的物理意義，但可用來表征纖維素結(jié)晶度的變化。

1.4 纖維素的X-射線衍射分析

采用菲力普公司生產(chǎn)的X-射線衍射儀(X'pert Pro MPD，Philip)對(duì)樣品進(jìn)行分析。分析條件:采用Co靶，加速電壓40 kV，電流30 mA，步長(zhǎng)0.013°/2θ，掃描速度 2°/min，掃描范圍 4.9°～95°。

根據(jù)式(3)計(jì)算纖維素的結(jié)晶度(Esat＆Mustafa，2006):

式中，I002為 002 面衍射強(qiáng)度;I18.0°為衍射角2θ=18.0 °的衍射強(qiáng)度。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的基本處理;采用SPSS軟件包中的方差分析過程(ANOVA)對(duì)不同水稻品種各化學(xué)組分、紅外光譜吸收峰相對(duì)強(qiáng)度、紅外結(jié)晶指數(shù)以及紅外結(jié)晶度進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻秸稈化學(xué)成分分析

秸稈化學(xué)成分可以說明其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，與該水稻品種的營(yíng)養(yǎng)生理和養(yǎng)分傳輸積累特性，以及特定的栽培管理與生產(chǎn)水平有關(guān)(沈恒勝等，2001b;Ma et al.，2001)。轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)品1、轉(zhuǎn)品8與對(duì)照的化學(xué)成分見表1。不同部位的化學(xué)成分分析結(jié)果表明，秸稈葉片、葉鞘、莖中的粗蛋白含量表現(xiàn)為葉片＞葉鞘＞莖;纖維素含量為莖＞葉鞘＞葉片;半纖維素的含量以莖為最低，葉片與葉鞘含量近似。不同品種同一部位的化學(xué)成分分析結(jié)果顯示，在秸稈葉片中，轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)品1和轉(zhuǎn)品8與對(duì)照的纖維素、木質(zhì)素及粗蛋白的含量基本相同，七絲軟粘的半纖維素含量稍低于轉(zhuǎn)品1和轉(zhuǎn)品8。在秸稈葉鞘中，七絲軟粘的半纖維素、纖維素含量比轉(zhuǎn)品1和轉(zhuǎn)品8稍高，木質(zhì)素及粗蛋白質(zhì)的含量差異不大。在秸稈莖中，半纖維素含量表現(xiàn)為轉(zhuǎn)品1(34.6%)＞轉(zhuǎn)品8(31.4%)＞七絲軟粘(28.2%);纖維素含量則表現(xiàn)為七絲軟粘(33.3%)＞轉(zhuǎn)品8(31.5%)＞轉(zhuǎn)品1(28.8%)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性分析表明，雖然不同品種間部分化學(xué)成分有所差異，但差異未達(dá)到顯著水平。

表1 表達(dá)廣譜抗真菌蛋白轉(zhuǎn)基因水稻秸稈不同組織部位的化學(xué)成分分析Table 1 The chemical composition of different parts of transgenic rice plants expressing broad-spectrum antifungal proteins

2.2 水稻秸稈硅化及其溶解特性分析

沈恒勝等(2001)對(duì)稻草硅的吸收、傳遞、在不同組織部位的分布以及可溶性與不可溶硅的存在形式進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)品種的嗜硅能力關(guān)系著品種的光系統(tǒng)活性和抗病、抗倒伏特性，同時(shí)，硅的溶解比率影響秸稈的化學(xué)成分和降解效率。表達(dá)廣譜抗真菌蛋白轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)品1和轉(zhuǎn)品8秸稈的總硅含量和硅溶解特性見圖1。分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)品1和轉(zhuǎn)品8與對(duì)照的總硅含量和硅溶解率接近，且總硅含量表現(xiàn)為葉片、葉鞘＞莖，可溶硅和硅溶解率表現(xiàn)為葉片＞莖、葉鞘。已有研究(胡定金等，1995;Yoshida et al.，1962)顯示，秸稈不同組織部位的總硅含量及硅溶解率的改變可能與水稻成熟時(shí)硅的傳輸途徑有關(guān)，為避免過度蒸騰作用，在葉鞘的外表皮層和葉片的上下表皮層形成了大量不可溶硅質(zhì)細(xì)胞與葉毛。不同品種同一部位的分析結(jié)果顯示，在葉片中，轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)品1和轉(zhuǎn)品8與對(duì)照的總硅含量基本相同，硅溶解率稍高于七絲軟粘;在葉鞘中，轉(zhuǎn)品1和轉(zhuǎn)品8的硅溶解率略低于七絲軟粘，總硅含量差異不大;莖中的硅溶解率表現(xiàn)為轉(zhuǎn)品8(56.5%)高于七絲軟粘(51.7%)和轉(zhuǎn)品1(48.9%)。差異顯著性分析結(jié)果顯示，3個(gè)供試水稻品種的總硅及硅溶解率不存在顯著差異。

2.3 纖維素的紅外光譜特征

秸稈中纖維素的官能團(tuán)和化學(xué)鍵在紅外光譜中的特定頻率均已明確，因此，通過紅外光譜可以定性和定量分析纖維素中存在的官能團(tuán)以及它們?cè)谵D(zhuǎn)基因水稻及對(duì)照中的變化。轉(zhuǎn)基因水稻及對(duì)照秸稈纖維素的紅外光譜圖分析表明，3個(gè)水稻品種秸稈不同部位纖維素的紅外吸收峰形狀基本相同。

紅外光譜圖中各吸收峰的相對(duì)吸收強(qiáng)度見表2。其中，波數(shù)3400 cm－1表征纖維素分子內(nèi)羥基O-H伸縮振動(dòng)譜帶，波數(shù)2900 cm－1表征纖維素分子間羥基O-H伸縮振動(dòng)的吸收峰，波數(shù)1637 cm－1表征吸附水的吸收峰，波數(shù)1432 cm－1表征纖維素－CH2彎曲振動(dòng)和剪切振動(dòng)的吸收峰。波數(shù)1372 cm－1和1163 cm－1分別表征纖維素和半纖維素中－CH彎曲變型振動(dòng)和C-OC不對(duì)稱伸縮振動(dòng)的吸收峰，1058～1060 cm－1表征纖維素和半纖維素中C=O伸縮振動(dòng)的吸收峰，898 cm－1處為β-糖苷鍵振動(dòng)吸收峰。這些吸收峰強(qiáng)度在轉(zhuǎn)基因水稻及對(duì)照間無顯著差異，說明轉(zhuǎn)基因水稻與對(duì)照秸稈纖維大分子的結(jié)構(gòu)基本一致。

圖1 表達(dá)廣譜抗真菌蛋白轉(zhuǎn)基因水稻秸稈的總硅含量(A)和硅溶解效率(B)Fig.1 Mean total silicon content(A)and the efficiency of extraction of biogenic silicon(B)of transgenic vs.non-transgenic rice plants expressing broad-spectrum antifungal proteins

表2 表達(dá)廣譜抗真菌蛋白轉(zhuǎn)基因水稻秸稈纖維素紅外光譜吸收峰相對(duì)強(qiáng)度Table 2 The relative intensity of infrared spectrum absorption peaks of straw cellulose in transgenic rice plants expressing broad-spectrum antifungal proteins

2.4 纖維素的X-射線衍射特征

秸稈中的纖維素是由結(jié)晶區(qū)和無定形區(qū)交錯(cuò)結(jié)合的復(fù)雜體系。利用X射線照射樣品，具有結(jié)晶結(jié)構(gòu)的物質(zhì)會(huì)發(fā)生衍射并形成一定特性的X-射線衍射圖，由此可用來研究纖維素的內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)基因水稻及對(duì)照秸稈不同組織部位纖維素的X-射線衍射圖見圖2。

從圖2中可以看出，轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)品1和轉(zhuǎn)品8秸稈的X-射線衍射圖與對(duì)照基本一致。在22.0°和18.0°都各有一個(gè)主要峰和次要峰，主要峰代表002面峰的強(qiáng)度，即結(jié)晶區(qū)的衍射強(qiáng)度;次要峰代表無定形區(qū)的衍射強(qiáng)度(Masakazu＆Yasuhiko，1996)。由此可知，轉(zhuǎn)基因水稻及對(duì)照秸稈不同組織部位的纖維素晶體類型相同，保持著晶區(qū)與非晶區(qū)共存的狀態(tài)。

2.5 纖維素的紅外結(jié)晶指數(shù)與結(jié)晶度分析

纖維素的結(jié)晶度是指纖維素構(gòu)成的結(jié)晶區(qū)占纖維素整體的百分率，反映了纖維素聚集時(shí)形成結(jié)晶的程度，可由紅外光譜圖與X-射線衍射圖計(jì)算得出。何艷峰等(2007)采用 O′KI、N·O′KI以及 CrI研究經(jīng)堿處理的秸稈，發(fā)現(xiàn)其纖維素形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。由表3可以看出，不同品種的同一組織部位，經(jīng)紅外光譜圖計(jì)算得到的 O′KI、N·O′KI，以及經(jīng)X-射線衍射圖計(jì)算得出的CrI數(shù)值略有不同，但顯著性分析結(jié)果表明，不同品種間的結(jié)晶指數(shù)和結(jié)晶度不存在顯著差異，這說明轉(zhuǎn)品1和轉(zhuǎn)品8的纖維素結(jié)晶區(qū)及無定形區(qū)與對(duì)照基本一致。

圖2 表達(dá)廣譜抗真菌蛋白轉(zhuǎn)基因水稻不同組織部位纖維素的X-射線衍射圖Fig.2 XRD spectra of cellulose in different parts of straw in transgenic(Zhuanpin 1 and 8)rice plants expressing broad-spectrum antifungal proteins vs.non-transgenic equivalent(Quishiruanzhan)

表3 表達(dá)廣譜抗真菌蛋白轉(zhuǎn)基因水稻秸稈不同組織部位纖維素的紅外結(jié)晶指數(shù)與結(jié)晶度Table 3 The infrared crystalline indices and crystallinity of cellulose in different parts of straw in transgenic rice plants expressing broad-spectrum antifungal proteins

3 討論

國(guó)內(nèi)外對(duì)水稻秸稈營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的研究較多，包括對(duì)秸稈硅含量的分析(王佳壟等，2008;Wang et al.，2006)，但有關(guān)轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因水稻在化學(xué)組成方面是否存在差異的研究甚少。化學(xué)成分分析是評(píng)估轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的非期望效應(yīng)的基礎(chǔ)，是轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容(唐茂芝等，2005)。因此，本研究對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻秸稈的化學(xué)成分和硅化及其溶解特性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，表達(dá)廣譜抗真菌蛋白轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)品1、轉(zhuǎn)品8與對(duì)照沒有顯著差異。沈恒勝等(2001a)對(duì)稻草不同組織部位的纖維組成與硅溶解特性分析后發(fā)現(xiàn)，稻草中纖維素含量表現(xiàn)為莖＞鞘＞葉，總硅和半纖維素的含量以莖為最低，木質(zhì)素含量則以葉為最高。本研究結(jié)果與該結(jié)果基本一致。楊秉耀等(2006)和Belanger et al.(1995)認(rèn)為，水稻的硅質(zhì)細(xì)胞大小和含量與水稻的真菌抗性存在著密切的聯(lián)系。但本文的研究結(jié)果顯示，抗真菌轉(zhuǎn)基因水稻品種的總硅及硅溶解率與對(duì)照不存在顯著差異，說明幾丁質(zhì)酶基因和苜蓿葡聚糖酶基因的導(dǎo)入未引起水稻植株化學(xué)成分的明顯變化。

纖維素是構(gòu)成細(xì)胞壁的基本物質(zhì)，約占植物干重的50%，在植物體內(nèi)起著重要的支撐作用，為水稻生殖生長(zhǎng)奠定基礎(chǔ)(韋存虛等，2008)。但外源基因的導(dǎo)入是否會(huì)使水稻秸稈纖維超微結(jié)構(gòu)和晶體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化，目前還未見深入報(bào)道。本文采用FTIR和XRD方法研究轉(zhuǎn)基因水稻不同部位的纖維素分子結(jié)構(gòu)及晶體結(jié)構(gòu)的變化情況，結(jié)果顯示，其與對(duì)照并沒有顯著性差異。據(jù)此可以認(rèn)為，廣譜抗真菌基因的導(dǎo)入不會(huì)對(duì)秈稻纖維素分子結(jié)構(gòu)和晶體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯影響。

對(duì)轉(zhuǎn)基因作物植株化學(xué)成分的差異分析僅是轉(zhuǎn)基因植物安全性評(píng)價(jià)的一個(gè)方面。要想完善轉(zhuǎn)基因水稻的安全性評(píng)價(jià)體系，還需對(duì)其食用安全性以及對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響進(jìn)行深入研究。

董金皋，黃梧芳.1995.植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)與抗病性.植物病理學(xué)報(bào)，25(1):1－3.

國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局.1994.中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB/T 6432－1994飼料中粗蛋白測(cè)定方法.http://www.techfood.com/kndata/1029/0059792.htm.

何艷峰，李秀金，方文杰，康佳麗.2007.NaOH固態(tài)預(yù)處理對(duì)稻草中纖維素結(jié)構(gòu)特性的影響.可再生能源，25(5):31－34.

胡定金，謝振翅，王富華.1995.水稻硅、鋅、錳配施效應(yīng).植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，(Z1):3－4，81－88.

彭維，向志明.2007.水稻秸稈的纖維素酶水解研究.四川食品與發(fā)酵，43(3):11－15.

沈恒勝，陳君琛，倪德斌.2001a.稻草硅化和溶解特性對(duì)稻草纖維降解率及其利用的影響.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，34(6):672－678.

沈恒勝，陳君琛，謝華安.2001b.汕優(yōu)63稻草營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)與品種特性的關(guān)系.福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，16(2):1－5.

唐茂芝，黃昆侖，唐小革，周可，羅云波.2005.外源蛋白基因?qū)γ拮褷I(yíng)養(yǎng)成分影響的研究.食品科學(xué)，26(11):55－58.

王關(guān)林，方宏筠.2009.植物基因工程.北京:科學(xué)出版社.

王佳壟，葉丹妮，李文婷，劉建新.2008.化學(xué)預(yù)處理對(duì)稻草硅化程度的影響及其對(duì)瘤胃降解率的改善效果.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，20(2):170－175.

韋存虛，謝佩松，周衛(wèi)東，陳義芳，嚴(yán)長(zhǎng)杰.2008.水稻脆性突變體葉的解剖結(jié)構(gòu)和化學(xué)特性.作物學(xué)報(bào)，34(8):1417－1423.

楊秉耀，陳新芳，劉向東，郭海斌.2006.水稻不同品種葉表面硅質(zhì)細(xì)胞的掃描電鏡觀察.電子顯微學(xué)報(bào)，25(2):146－149.

葉君，熊犍.1999.超聲波處理引起紙漿纖維素結(jié)晶度變化.廣東造紙，(2):6－10.

張志忠，吳菁華，呂柳新，林義章.2005.植物幾丁質(zhì)酶及其應(yīng)用研究進(jìn)展.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，34(4):494－499.

Belanger R R，Bowen P A，Ehret D L and Menzies J G.1995.Soluble silicon its role in crop and disease management of greenhouse crops.Plant Disease，79:329 －335.

Esat G and Mustafa U.2006.Dependence of chemical and crystailine structure of alkali sulfite pulp on cooking temperature and time.Carbohydrate Polymers，65:461 －468.

Ma J F，Miyake Y and Takahashi E.2001.Silicon as a beneficial element for crop plants∥Datnoff L E，Snyder G H and Korndorfer G H.Silicon in Agriculture.New York:Elsevier Science，17 －39.

Masakazu G and Yasuhiko Y.1996.Ammoniation of barley straw:effect on cellulose crystallinity and water-holding capacity.Animal Feed Science Technology，58:239 －247.

Soest P J and Robertson J B.1985.Analysis of Forages and Fibrous Food—A Laboratory Manual for Animal Science 613.New York:Cornell University Press.

Soest P J，Robertson J B and Lewis B A.1991.Method for dietary fiber，neutral detergent fiber，and non-starch polysaccharides in relation to animal nutrition.Journal of Dairy Sciences，74:3583 －3597.

Wang H F，Wu Y M，Liu J X and Qian Q.2006.Morphological fractions，chemical compositions and in vitro gas production of rice straw from wild and brittle culm1 variety harvested at different growth stages.Animal Feed Science and Technology，129:159 －171.

Yoshida S，Ohnishi Y and Kjtagishi K.1962.Histochemistry of the rice plant.II.Localisation of silicon within the rice tissues.Soil Science and Plant Nutrition，8:36 －41.