呂春茂，王新現(xiàn)，董文軒*，孟憲軍，王 博

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

響應(yīng)面法優(yōu)化越橘花色苷微波輔助提取工藝參數(shù)

呂春茂1,2，王新現(xiàn)2，董文軒1,*，孟憲軍2，王 博2

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

為優(yōu)化越橘花色苷提取工藝，運(yùn)用微波輔助提取法，以含鹽酸1%的乙醇溶液為提取劑，通過單因素試驗(yàn)對微波功率、時(shí)間、溶劑體積分?jǐn)?shù)和溫度等工藝條件進(jìn)行研究，并通過提取工藝的響應(yīng)面法，得出越橘果實(shí)花色苷的提取回歸方程。結(jié)果表明，越橘果實(shí)花色苷的最佳提取工藝條件為微波功率500W、提取時(shí)間7min、乙醇體積分?jǐn)?shù)55%、溫度51℃。最優(yōu)工藝條件下提取量為(1.47±0.15)mg/g。

越橘；花色苷；提取工藝；響應(yīng)面法

越橘(bilberry)，又稱藍(lán)漿果或藍(lán)莓果，屬于杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vacciniumspp.)植物，全世界廣泛分布，分布于我國的越橘屬植物已有91種[1]。越橘果實(shí)營養(yǎng)豐富，其中富含的花色苷更是具有多種保健和營養(yǎng)功能[2-3]。近年來越橘的消費(fèi)市場逐年擴(kuò)大，被稱為繼蘋果和柑橘之后的“世界第三代水果”[4]。

近年來國內(nèi)外在植物花色苷提取方面已做了大量研究，已知的植物花色苷提取方法有熱水提取法、醇提法、堿性水或堿性稀醇提取法、有機(jī)溶劑萃取法、超聲法等[5-7]，但應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化越橘花色苷微波輔助提取方面還鮮見報(bào)道。響應(yīng)面分析法(re sp on se surfac e methodology，RSM)是一種優(yōu)化工藝條件的有效方法，可用于確定各因素及其交互作用在工藝過程中對指標(biāo)(響應(yīng)值)的影響，精確地表述因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系[8-9]。本研究應(yīng)用微波輔助提取法，選取功率、時(shí)間、溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)等因素，利用響應(yīng)面法優(yōu)化越橘花色苷的最佳提取工藝參數(shù)，以期為越橘花色苷的研究開發(fā)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

野生越橘，2009年6月采于長白山，冰袋冷藏運(yùn)輸，實(shí)驗(yàn)室冷凍儲藏。

丙酮、乙醇、甲醇、鹽酸、冰乙酸、氯化鉀、無水醋酸鈉(均為分析純)。

FD-IC-80真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空抽濾裝置 上海華琦科學(xué)儀器有限公司；MAS-Ⅰ型常壓微波輔助合成/萃取反應(yīng)儀 上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；FW80-1高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有公司；TU-1810紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料處理

將新鮮的越橘凍果打漿，在冰箱中預(yù)冷凍，放入冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，干燥品用萬能粉碎機(jī)進(jìn)行破碎，破碎粉放入冰箱冷藏室備用。

1.2.2 工藝流程

越橘果實(shí)冷凍干燥粉→微波輔助提取→真空抽濾→減壓濃縮→真空干燥→花色苷粗品→花色苷粗品溶解定容→花色苷特定吸收波長處測定吸光度

1.2.3 單因素試驗(yàn)

在提取溶劑一定，其他條件一致的前提下，運(yùn)用微波輔助提取法分別研究微波功率、提取溫度、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)對越橘花色苷色素提取效果的影響。

1.2.4 響應(yīng)面分析優(yōu)化提取參數(shù)的研究

為綜合考慮各因素對越橘花色苷色素提取量的影響，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，以與色素提取量呈正比的花色苷吸光度差值(A)為優(yōu)化指標(biāo)，對影響顯著的提取溫度、時(shí)間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)4個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)(表1)，設(shè)計(jì)了四因素三水平共計(jì)29組試驗(yàn)(中心點(diǎn)重復(fù)5次，用于估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平及編碼Table 1 Coded factors and their coded levels in response surface design

1.2.5 提取物的評價(jià)方法

采用差異pH法[10-12]測定提取液中色素含量。

A=(Aλmax－A700)pH1.0－(Aλmax－A700)pH4.5

A為待測溶液中花色苷吸光度；Aλmax為待測溶液在最大吸收波長的吸光度；A700為待測溶液在700nm時(shí)的吸光度；pH1.0為待測溶液在pHl.0條件下測定；pH4.5為待測溶液在pH4.5條件下測定。

根據(jù)文獻(xiàn)[13-15]，越橘果實(shí)中花色苷含量計(jì)算公式如下：

式中：X為越橘果實(shí)花色苷含量/(mg/g)；A為吸光度；V為定容體積/L；F為稀釋倍數(shù)；M為矢車菊色素-3-葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量，449.2；ε為矢車菊色素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)，26900；m為樣品干質(zhì)量/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 越橘花色苷最大吸收波長

花色苷粗品0.3g溶于60%乙醇并定容，取1mL用pH1.0的緩沖溶液定容至25mL，全波長掃描越橘果實(shí)花色苷緩沖液，得出曲線，如圖1所示。

圖1 越橘果實(shí)花色苷緩沖液全波長掃描圖Fig.1 Scanning spectrum of bilberry anthocyanins

由圖1可以看出，越橘果實(shí)花色苷粗提液在紫外區(qū)270～280nm和可見區(qū)510～530nm之間有吸收峰的出現(xiàn)，屬于花色苷及其衍生物特征吸收峰的范圍[16]。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 溶劑種類對越橘果實(shí)花色苷提取量的影響

在微波功率500W、溫度50℃、提取時(shí)間7min、料液比1:200的條件下，運(yùn)用微波輔助提取法，考察了不同溶劑蒸餾水、丙酮、甲醇、乙醇越橘果實(shí)花色苷的吸光度值的變化，結(jié)果見圖3，甲醇對越橘的花色苷吸光度值最大，乙醇略低，丙酮、蒸餾水次之。但因?yàn)榧状寂c乙醇對花色苷提取效果的影響相差不大，且乙醇無毒、原料便宜，故選擇乙醇做提取溶劑。

圖2 溶劑對越橘果實(shí)花色苷提取量的影響Fig.2 Effects of different solvents on extraction efficiency of anthocyanins

2.2.2 鹽酸乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)對越橘果實(shí)花色苷提取量的影響

在微波功率500W、溫度50℃、提取時(shí)間7min、料液比1:200的條件下，運(yùn)用微波輔助提取法，考察不同體積分?jǐn)?shù)的鹽酸乙醇溶液花色苷提取劑越橘果實(shí)花色苷的吸光度的變化，結(jié)果如圖3所示。

圖3 鹽酸乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)對越橘果實(shí)花色苷提取量的影響Fig.3 Effect of HCl concentration on extraction efficiency of anthocyanins

由圖3可知，含1% HCl的乙醇提取液越橘花色苷的吸光度最大。這說明采用鹽酸-乙醇溶液進(jìn)行越橘花色苷提取過程中，低體積分?jǐn)?shù)的鹽酸-乙醇溶液有利于花色苷提取，高體積分?jǐn)?shù)則可能破壞花色苷結(jié)構(gòu)[17]，從而導(dǎo)致提取量下降。

2.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對越橘果實(shí)花色苷提取量的影響

在微波功率500W、溫度50℃、提取時(shí)間7min、料液比1:200的條件下，運(yùn)用微波輔助提取法，考察含1% HCl的不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液微波輔助提取越橘果實(shí)中的花色苷吸光度的變化，結(jié)果如圖4所示。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對越橘果實(shí)花色苷提取量的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on extraction efficiency of anthocyanins

由圖4可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，花色苷吸光度先是穩(wěn)步上升而后緩慢遞減，其中含1% HCl的60%乙醇溶液對花色苷的提取效果最好。

2.2.4 微波功率對越橘花色苷提取量的影響

以含1% HCl的60%乙醇溶液為提取溶劑，在溫度50℃、提取時(shí)間7min、料液比1:200的條件下，選用不同功率微波輔助提取越橘果實(shí)中的花色苷，結(jié)果如圖5所示。

圖5 微波功率對越橘果實(shí)花色苷提取量的影響Fig.5 Effect of microwave power on extraction efficiency of anthocyanins

由圖5可知，微波輔助提取時(shí)，當(dāng)微波功率上升時(shí)，花色苷吸光度先緩慢提高，當(dāng)功率達(dá)到500W時(shí)，花色苷吸光度達(dá)到最高，隨后降低。這可能是因?yàn)楫?dāng)微波功率太高時(shí)造成溫度太高，導(dǎo)致花色苷分解。

2.2.5 溫度對越橘花色苷提取量的影響

以含1% HCl的60%乙醇溶液為提取溶劑，在微波功率500W、提取時(shí)間7min、料液比1:200的條件下，考察不同溫度對越橘果實(shí)花色苷吸光度的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 溫度對越橘果實(shí)花色苷提取量的影響Fig.6 Effect of extraction temperature on extraction efficienc of anthocyanins

溫度對花色苷提取效果影響很大，本實(shí)驗(yàn)提取溫度為50℃花色苷吸光度最大。適當(dāng)?shù)臏囟瓤梢暂o助提取溶劑和越橘果實(shí)凍干粉融合，加速越橘果實(shí)內(nèi)花色苷的溶出。但溫度過高會使花色苷分解，使花色苷提取率下降。

2.2.6 時(shí)間對越橘花色苷提取量的影響

以含1% HCl的60%乙醇溶液為提取溶劑，在微波功率500W、提取溫度50℃、料液比1:200的條件下，不同微波輔助提取時(shí)間對越橘果實(shí)花色苷提取量的影響，如圖7所示。

圖7 提取時(shí)間對越橘果實(shí)花色苷提取量的影響Fig.7 Effect of extraction time on extraction efficiency of anthocyanins

越橘果實(shí)花色苷吸光度隨微波時(shí)間的延長緩慢增長，當(dāng)提取時(shí)間到達(dá)7min時(shí)，吸光度達(dá)到最大，隨后下降。因?yàn)樵?0℃條件下，隨著時(shí)間的延長，也會有部分花色苷分解，相應(yīng)樣品的吸光度就會略有下降。

2.3 響應(yīng)面分析

2.3.1 響應(yīng)面分析優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方差分析

表2 響應(yīng)面分析方案與試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Protocol and experimental results of response surface design

根據(jù)Box-behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取微波功率、提取時(shí)間、微波溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis of regression model

由表3數(shù)據(jù)處理結(jié)果可知，P值小于0.05時(shí)，表明此模型顯著，且此模型中一次項(xiàng)A、C和二次項(xiàng)均為顯著項(xiàng)。并且該模型的R2=98.32，說明此模型與實(shí)驗(yàn)實(shí)際擬合較好，實(shí)驗(yàn)失擬性小，因此可用該回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析?；貧w系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表明，在所各取的因素水平范圍內(nèi)，對越橘果實(shí)花色苷提取率影響排序?yàn)闇囟龋竟β剩緯r(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。2.3.2 擬合模型的建立

通過中心組合試驗(yàn)獲得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，運(yùn)用DX 7-Trial軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行整理分析，確立如下回歸預(yù)測模型：

Y=0.17460＋2.41667×10-3A＋7.50000×10-4B＋2.50000×10-3C－1.66667×10-4D－7.50000×10-4AB＋2.50000×10-4AC－2.50000×10-4AD＋2.50000×10-4BC＋2.50000BD＋4.33681×10-19CD－0.018800A2－5.30000×10-3B2－0.010175C2－2.67500×10-3D2

2.3.3 響應(yīng)面分析

從圖8可以看出，溫度對越橘花色苷的提取影響最大，功率次之，提取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)對越橘果實(shí)花色苷提取量影響不顯著。通過軟件分析，得到越橘果實(shí)花色苷的最佳提取條件為溫度51.24℃、微波功率506.7W、提取時(shí)間7.06min、乙醇體積分?jǐn)?shù)55.4%。在此條件下花色苷提取量預(yù)測值為1.47mg/g(吸光度預(yù)測為0.1755)。

實(shí)際操作中將響應(yīng)面分析法優(yōu)化的提取工藝條件適當(dāng)調(diào)整為溫度51℃、微波功率500W、提取時(shí)間7min、乙醇體積分?jǐn)?shù)55%，在此條件下對越橘果實(shí)花色苷進(jìn)行3次提取實(shí)驗(yàn)，花色苷提取量為(1.47±0.15)mg/g，響應(yīng)面的實(shí)驗(yàn)值與回歸方程預(yù)測值吻合良好。

圖8 各兩因素交互作用對花色苷提取量的影響Fig.8 Response surface plots showing the pairwise interactive effects of four factors on extraction efficiency of anthocyanins

3 結(jié) 論

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，微波輔助提取越橘果實(shí)花色苷時(shí)，用體積分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸化乙醇、微波功率500W、時(shí)間7min、溫度50℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%時(shí)，越橘果實(shí)花色苷的提取量達(dá)到最大值。

微波輔助提取越橘果實(shí)凍干粉花色苷過程中，各因素對越橘花色苷提取量影響從大到小依次為溫度、微波功率、時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)。

應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝條件，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果為溫度51℃、微波功率500W、提取時(shí)間7min、乙醇體積分?jǐn)?shù)55%，在此條件下越橘果實(shí)花色苷提取量為(1.47±0.15)mg/g。

[1] 李亞東, 劉海廣, 張志東, 等. 我國藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J]. 中國果樹, 2008(6): 67-71.

[2] 陳玉峰, 李凌. 越橘(Vacciniumspp.)果實(shí)色素提取條件及其性質(zhì)的研究[D]. 重慶: 西南大學(xué), 2008.

[3] 陳介甫, 李亞東, 徐哲. 藍(lán)莓的主要化學(xué)成分及生物活性[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 45(4): 422-429.

[4] 孟凡麗, 李亞東. 越橘果實(shí)中花色苷的提取分離、定量和結(jié)構(gòu)鑒定研究[D]. 長春: 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué), 2003.

[5] 李穎暢. 藍(lán)莓果中花色素苷的研究進(jìn)展[J]. 食品研究與開發(fā), 2007,28(1): 178-181.

[6] GRACE M H, RIBNICKY D M, KUHN P, et al. Hypoglycemic activity of a novel anthocyanin-rich formulation from lowbush blueberry,Vaccinium angustifoliumAiton[J]. Phytomedicine, 2009, 16(5): 406-415.

[7] BARNES J S, NGUYEN H P, SHEN Sijia, et al. General method for extraction of blueberry anthocyanins and identification using high performance liquid chromatography-electrospray ionization-ion traptime of flight-mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2009,1216(23): 4728-4735.

[8] 慕運(yùn)動. 響應(yīng)面方法及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J]. 鄭州工業(yè)學(xué)報(bào), 2001(9): 91-94.

[9] 王若蘭, 劉麗媛. 食用油提取番茄紅素的工藝研究[J]. 食品科學(xué),2008, 29(12): 288-291.

[10] WROLSTAD R E, SCHWARTZ S J. Hand-book of food analytical chemistry water, proteins, enzyme, lipids, and carbohydrates[M].Hoboken, New Jersey: John Wiley, 2005.

[11] 陳偉, 孟憲軍, 王立男. 玫瑰花紅色素提取工藝研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2006, 27(3): 50-52.

[12] ORDAZ-GALINDAO A, WESCHE-EBELING P, WROLSTAD R E,et al. Purification and identification of Capulin (Prunus serotina Ehrh)anthocyanins[J]. Food Cheminstry, 1999, 65(2): 201-206.

[13] FULEKI T. Quantitative methods for anthocyanins.Ⅰ. Extraction and deternination of total anthocyanins in Cranberries[J]. J Food Science,1968, 33(1): 72-77.

[14] 王少波, 杜永峰, 姚秉華. pH示差法測定黑豆皮中的花青素[J]. 化學(xué)分析計(jì)量, 2008, 17(1): 46-49.

[15] HOSSEINIAN F S, LI Wende, BETA T. Measurement of anthocyanins and other phytochemicals in purple wheat[J]. Food Chemistry, 2008, 109(4): 916-924.

[16] 董怡, 林松怡. RP-HPLC法優(yōu)化篤斯越橘花青素提取, 純化技術(shù)研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(10): 349-352.

Optimization of Microwave-assisted Extraction Process for Anthocyanins from Bilberry by Response Surface Methodology

In order to optimize the microwave-assisted extraction process for anthocyanins from bilberry using 1% HCl ethanol as the solvent, response surface methodology was used to explore the effects of microwave power, microwave treatment time,solvent concentration and extraction temperature on extraction rate of anthocyanins on the basis of single-factor investigations.Results indicated that the optimal extraction conditions for anthocyanins from bilberry was microwave powder of 500 W,microwave treatment time of 7 min, solvent concentration of 55%, and extraction temperature of 51 ℃. Under the optimal extraction conditions, their extraction efficienc of anthocyanins from bilberry was (1.47 ± 0.15) mg/g.

bilberry；anthocyanins；extraction processing；response surface methodology (RSM)

TS255.1

A

1002-6630(2011)06-0071-05

2010-05-19

沈陽市青年人才基金計(jì)劃項(xiàng)目(1081240-1-02)；沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)博士后基金項(xiàng)目

呂春茂(1970—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：bt_lcm@126.com

*通信作者：董文軒(1963—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)楣麡浞N質(zhì)資源。E-mail：wxdong63@126.com