黃 鍵，陳 燕，全晶晶，張春丹，李 曄，裘迪紅，湯海青，李和生，蘇秀榕,*，章超樺，秦小明

(1.寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江 寧波 315211；2.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088)

瓶裝泥螺和蟹糊可培養(yǎng)細(xì)菌的分離與鑒定

黃 鍵1，陳 燕1，全晶晶1，張春丹1，李 曄1，裘迪紅1，湯海青1，李和生1，蘇秀榕1,*，章超樺2，秦小明2

(1.寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江 寧波 315211；2.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088)

為提高泥螺和蟹糊的貯藏時(shí)間，確保生食的食用安全性，本實(shí)驗(yàn)利用常規(guī)方法從瓶裝泥螺中分離和鑒定出3株細(xì)菌，分別是彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)、綠色氣球菌(Aerococcus viridans)和乳酪短桿菌(Brevibacterium casei)；從瓶裝蟹糊中分離和鑒定出的4株細(xì)菌分別為：雞葡萄球菌(Staphylococcus gallinarum)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)和纖細(xì)發(fā)光桿菌(Photobacterium angustum)。16S rRNA鑒定鑒定結(jié)果表明只有纖細(xì)發(fā)光桿菌的鑒定結(jié)果與MIS鑒定的結(jié)果不一致。除卡他莫拉菌、綠色氣球菌和乳酪短桿菌外，其余菌都隨著溫度升高，長(zhǎng)勢(shì)增強(qiáng)。7株細(xì)菌中除卡他莫拉菌在低溫冷藏(4℃)條件下長(zhǎng)勢(shì)明顯增加外，其余菌都在低溫冷藏(4℃)條件下長(zhǎng)勢(shì)明顯減弱。7株菌都具有膠原蛋白酶和酪蛋白酶活性，藤黃微球菌和纖細(xì)發(fā)光桿菌不能分解利用淀粉，所有的分離菌株都沒(méi)有酯酶活性。這些菌的生長(zhǎng)溫度范圍為4～35℃(最適溫度35℃)，鹽度范圍為3%～7%(最適鹽度3%)，pH值范圍5.0～9.0(最適pH7.0)。

泥螺；蟹糊；細(xì)菌自動(dòng)鑒定；16S rRNA；PCR擴(kuò)增

泥螺又名麥螺、梅螺、黃泥螺，是我國(guó)東部沿海重要的經(jīng)濟(jì)貝類(lèi)。其肉質(zhì)鮮美，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，深受人們的喜愛(ài)。泥螺經(jīng)腌制再加酒、糖等佐料配制后，咸甜適宜，味道鮮美，風(fēng)味獨(dú)特，一直是江浙沿海一帶廣大居民的傳統(tǒng)風(fēng)味食品。

蟹糊是一種特色腌制水產(chǎn)品。它是以新鮮三疣梭子蟹為原料，經(jīng)腌制后斬碎，再加上適量的酒、味精等調(diào)制而成。其加工工藝簡(jiǎn)單，能夠充分保持原料的鮮美風(fēng)味和豐富營(yíng)養(yǎng)，兼有易消化吸收、耗能少等諸多優(yōu)點(diǎn)。

近年來(lái)，隨著市場(chǎng)需求量的上升，蟹糊和泥螺由傳統(tǒng)家庭制作的散裝產(chǎn)品轉(zhuǎn)向工業(yè)化生產(chǎn)的瓶裝蟹糊、泥螺而暢銷(xiāo)全國(guó)各地。然而瓶裝蟹糊和瓶裝泥螺都屬生食水產(chǎn)品，受細(xì)菌污染普遍，又由于在加工過(guò)程中不能添加抑菌劑、防腐劑，也易受諸因素影響，難以控制細(xì)菌數(shù)量[1-3]。為了解瓶裝泥螺中的細(xì)菌類(lèi)別和組成，尋找一種細(xì)菌總數(shù)控制技術(shù)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)瓶裝泥螺和蟹糊產(chǎn)品中的細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定，并對(duì)其胞外酶活性和生長(zhǎng)條件進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

瓶裝泥螺和蟹糊(剛生產(chǎn)的)購(gòu)于寧波超市。

細(xì)菌自動(dòng)鑒定的皂化試劑、甲基化試劑、萃取溶劑、堿洗滌試劑 美國(guó)Sigma公司；PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；PCR擴(kuò)增試劑、pMD18-T載體 日本TaKaRa公司；DNA快速純化試劑盒 捷瑞生物工程上海有限公司；其他試劑為分析純。

TSBA培養(yǎng)基、胰蛋白酶大豆肉湯培養(yǎng)基 美國(guó)Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

無(wú)菌條件下開(kāi)啟瓶蓋，用無(wú)菌鑷子從瓶?jī)?nèi)上、中、下部分夾取樣品，剪碎、研磨，采用10倍稀釋法分離細(xì)菌。每批樣品取10瓶，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 細(xì)菌的分離純化及革蘭氏染色

采用涂布法，經(jīng)劃線純化后獲得純種菌落并進(jìn)行革蘭氏染色[4]。

1.2.3 細(xì)菌的Sherlock MIS自動(dòng)鑒定

將細(xì)菌劃線接種到含2.7% NaCl的TSBA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24h。用接種環(huán)從四區(qū)劃線中的第三區(qū)刮取一環(huán)，按照MIS Chapter操作手冊(cè)進(jìn)行皂化、甲基化、萃取、堿洗滌。利用7850型氣相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)進(jìn)行檢測(cè)。利用微生物鑒定系統(tǒng)(MIS)識(shí)別脂肪酸的種類(lèi)和數(shù)量，并與計(jì)算機(jī)自帶的數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)已知細(xì)菌的脂肪酸圖譜進(jìn)行比較，自動(dòng)讀取鑒定結(jié)果[5]。

1.2.4 細(xì)菌的分子生物學(xué)鑒定

1.2.4.1 DNA模板的制備[6]

挑取單菌落于25μL無(wú)菌超純水中，混勻，沸水浴裂解10min，10000r/min離心2min，取上清液，－20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)

采用16S rDNA通用引物，正向引物16SF：5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇；反向引物16SR：5＇-CCGTCAATTCCTTTRAGTTT-3＇。25μL PCR反應(yīng)體系為：10×buffer 2.5μL、25mmol/L MgCl22.5μL、2.5mmol/L dNTPs 2.0μL、10μmol/L 引物各1.0μL，1.0U Taq酶、模板DNA 0.5μL，無(wú)菌超純水補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行，循環(huán)參數(shù)為：95℃預(yù)變性4min；94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1.3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4.3 測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)割膠回收后連接至pMD18-T載體上，再轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α細(xì)胞中測(cè)序[7]。并將細(xì)菌的16S rDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中各種細(xì)菌的序列進(jìn)行比對(duì)[8-11]。

1.2.5 胞外酶活性測(cè)定

挑取單菌落接種到牛肉膏和蛋白胨液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24h。培養(yǎng)液于10000r/min離心10min，吸取上清液，用直徑為0.22μm的濾膜過(guò)濾得到胞外產(chǎn)物。將牛津杯置于淀粉瓊脂培養(yǎng)基、膠原蛋白瓊脂培養(yǎng)基、酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基、吐溫-80瓊脂培養(yǎng)基上，注入250μL胞外產(chǎn)物，35℃培養(yǎng)48h。分別用盧哥氏碘液、酸性氯化汞、10%三氯乙酸及10%三氯化鐵染色，觀測(cè)分解圈的大小[12]。

1.2.6 菌株生長(zhǎng)條件測(cè)定

分別以溫度、鹽度(不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl溶液)、pH值進(jìn)行單因素試驗(yàn)。用分光光度計(jì)測(cè)定菌液的OD400nm值，以表示菌的生長(zhǎng)狀況[13]。每組設(shè)兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離

從瓶裝泥螺中分離到3株細(xì)菌，編號(hào)為BE1、BE2、BE3；從瓶裝蟹糊中分離到4株細(xì)菌，編號(hào)為XH1、XH2、XH3、XH4；其中XH3、BE1分別為瓶裝蟹糊、泥螺中的優(yōu)勢(shì)菌。

2.2 細(xì)菌自動(dòng)鑒定

MIS操作系統(tǒng)規(guī)定第一選擇的相似指數(shù)(SI)在0.500以上，且第一選擇和第二選擇的SI差值大于0.100，則可以認(rèn)為鑒定結(jié)果為第一選擇所列的菌種名。若SI值在0.300到0.500之間，且第一選擇和第二選擇的SI差值大于0.100，則表明第一選擇與第二選擇分開(kāi)，鑒定可能成功，但是第一選擇所列的菌種為非典型的菌株。當(dāng)SI值小于0.300時(shí)，則認(rèn)為該菌株不存在于數(shù)據(jù)庫(kù)中，但軟件會(huì)給出一個(gè)最相關(guān)的菌株。

表1 Sherlock MIS細(xì)菌鑒定結(jié)果Table 1 Bacterial identification by using Sherlock MIS

從表1可知，在7株待鑒定細(xì)菌中，XH3、XH4、BE1鑒定的第一選擇SI值大于0.500，表明鑒定成功。XH1、XH2、BE2、BE3鑒定的第一選擇SI值小于0.300，系統(tǒng)對(duì)該菌的鑒定結(jié)果尚有待驗(yàn)證[14]。

2.3 細(xì)菌的16S rDNA序列擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)采用水煮法獲得的純種細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。圖1擴(kuò)增結(jié)果表明，在退火溫度56℃條件下，所有細(xì)菌均能擴(kuò)增出特異性目的條帶，條帶清晰且沒(méi)有雜帶，擴(kuò)增片斷約900～1000bp。

圖1 7株細(xì)菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR products for 7 bacterial strains

2.4 DNA序列比對(duì)

登陸NCBI網(wǎng)站，使用GeneBank BLSTN分析軟件與數(shù)據(jù)庫(kù)中各種細(xì)菌的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)，并依此構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。序列比對(duì)結(jié)果顯示，菌株與數(shù)據(jù)庫(kù)給出的已知菌株同源性均在99%以上。各菌株同源性最高的參考菌株及同源性見(jiàn)表2。在所分析的7株待測(cè)細(xì)菌中，有6株細(xì)菌16S rDNA序列分析的結(jié)果與MIS鑒定的結(jié)果相符合，一致性為85.71%，且有些結(jié)果達(dá)到了種的水平，表明鑒定結(jié)果的可靠性較高。

表2 16S rDNA序列比對(duì)及與MIS鑒定結(jié)果的比較Table 2 16S rDNA sequence alignment and comparison with MIS identification results

2.5 革蘭氏染色及胞外酶活性

表3 細(xì)菌革蘭氏染色及胞外酶活性測(cè)定結(jié)果Table 3 Gram staining and extracellular enzyme activity

由表3可見(jiàn)，瓶裝泥螺中分離到的3株細(xì)菌全部是革蘭氏陽(yáng)性菌，瓶裝蟹糊中分離到兩株革蘭氏陽(yáng)性菌，2株革蘭氏陰性菌。瓶裝蟹糊和泥螺中分離到的所有菌株都具有膠原蛋白酶和酪蛋白酶活性。蟹糊中有兩株細(xì)菌不能分解利用淀粉。所有的分離菌株都沒(méi)有酯酶活性。蟹糊和泥螺都是富含蛋白質(zhì)的食品，這些細(xì)菌將會(huì)分解其中的蛋白質(zhì)，對(duì)蟹糊和泥螺的貨架期產(chǎn)生影響。

2.6 分離細(xì)菌的生長(zhǎng)條件

2.6.1 溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

圖2 溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of temperature on bacterial growth

菌種在液體培養(yǎng)基中活化后，以相同的初始菌濃度，接種0.1mL于5mL的液體培養(yǎng)基中，分別置于4、25、35℃條件下培養(yǎng)12h。從圖2可知，多數(shù)細(xì)菌(包括兩株優(yōu)勢(shì)菌XH3和BE1)在35℃時(shí)長(zhǎng)勢(shì)最好，表明隨著溫度升高，細(xì)菌生長(zhǎng)速度加快。許多細(xì)菌在10℃以下難以生長(zhǎng)，嗜冷菌增殖緩慢，非嗜冷菌不耐低溫，生長(zhǎng)受到限制。7株細(xì)菌中有6株菌在低溫冷藏(4℃)條件下長(zhǎng)勢(shì)明顯減弱，表明低溫貯藏能在一定程度上抑制這些細(xì)菌的生長(zhǎng)，適當(dāng)延長(zhǎng)貨架期[15]。

2.6.2 鹽度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

圖3 鹽度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of salinity on bacterial growth

細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中活化后，以相同的初始菌濃度，接種0.1mL于5mL NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.0%、5.0%、7.0%的液體培養(yǎng)基中，置25℃條件下培養(yǎng)12h。從圖3可知，在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.0%～7.0%范圍內(nèi)，不同細(xì)菌對(duì)鹽度的適應(yīng)性差別較大。優(yōu)勢(shì)菌XH3和BE1都是廣耐鹽細(xì)菌，在實(shí)驗(yàn)組的各個(gè)不同鹽度條件下都生長(zhǎng)良好。

2.6.3 pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

圖4 pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of pH on bacterial growth

將細(xì)菌以相同的初始菌濃度，接種0.1mL于5mL pH值分別為5.0、7.0、9.0的液體培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)12h。從圖4可知，7株細(xì)菌都是在中性條件下長(zhǎng)勢(shì)最好，過(guò)酸、過(guò)堿生長(zhǎng)速度都會(huì)減弱。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)利用Sherlock MIS細(xì)菌鑒定技術(shù)鑒定出瓶裝泥螺中的3株細(xì)菌為彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)、綠色氣球菌(Aerococcus viridans)和乳酪短桿菌(Brevibacterium casei)。王國(guó)良等[16]分離和鑒定了養(yǎng)殖泥螺體內(nèi)的細(xì)菌絕大多數(shù)是革蘭氏陰性桿菌，占總菌株的88.15%。優(yōu)勢(shì)菌屬為腸桿菌科(Enterobacteriaceae) 61株、氣單胞菌屬(Aeromonas)58株、弧菌屬(Vibrio) 27株、假單胞菌屬(Pseudomonas)21株，其次有不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)11 株、莫拉氏菌屬(Moraxella)9 株、葡萄球菌屬(Staphylococcus)8株、芽孢桿菌屬(Bacillus) 8株、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)7株、微球菌屬(Micrococcus)2株，另有5株細(xì)菌在傳代中失去生長(zhǎng)能力。腸桿菌科細(xì)菌主要出現(xiàn)在7月和9月，5月弧菌屬細(xì)菌檢出率較高。所以，泥螺的加工與環(huán)境中的細(xì)菌種類(lèi)有關(guān)。

瓶裝蟹糊中鑒定出的細(xì)菌為雞葡萄球菌(Staphylococcus gallinarum)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)和纖細(xì)發(fā)光桿菌(Photobacterium angustum)。2008年，楊憲時(shí)等[17]鑒定了蟹糊中的細(xì)菌初期主要是棒狀桿菌(Corynebacterium spp.)、玫瑰色庫(kù)克菌(Kocuria rose)、葡萄球菌(Staphy lococcus)和馬紅球菌(Rhodococcus equi)。球菌是蟹糊加工中普遍存在的，這些菌多數(shù)為廣耐鹽細(xì)菌，低溫可抑制其生長(zhǎng)，在中性pH值條件下長(zhǎng)勢(shì)最好。所以，有效控制細(xì)菌增殖速度，對(duì)保證產(chǎn)品品質(zhì)和延長(zhǎng)貨架期是至關(guān)重要的。蟹糊和泥螺產(chǎn)品在生產(chǎn)過(guò)程中存在的細(xì)菌污染問(wèn)題主要源自?xún)蓚€(gè)方面：一是原料控制不嚴(yán)格，二是加工過(guò)程溫度控制不夠嚴(yán)格。整個(gè)加工過(guò)程的物料溫度應(yīng)控制在0～5℃，低溫貯藏是目前應(yīng)用最廣泛、最有效的抑菌方法。

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Isolation and Identification of Cultivable Microorganisms in Bottled Crab Paste and Salted Mudsnail

HUANG Jian1，CHEN Yan1，QUAN Jing-jing1，ZHANG Chun-dan1，LI Ye1，QIU Di-hong1，TANG Hai-qing1，LI He-sheng1，SU Xiu-rong1,*，ZHANG Chao-hua2，QIN Xiao-ming2
(1. Faculty of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China；2. College of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China)

In order to increase the storage time and ensure edible safety of crab paste and salted mudsnail, bacterial analysis of crab paste and salted mudsnail was conducted. Three bacterial strains were isolated from salted mudsnail and identified as Bacillus flexus, Aerococcus viridans and Brevibacterium casei. Similarly, 4 bacterial strains were isolated from crab paste and identified as Staphylococcus gallinarum, Moraxella catarrhalis, Micrococcus luteus and Photobacterium angustum. In addition, highly consistent results were observed between 16S rRNA analysis and MIS identification among these strains expect for Photobacterium angustum. Most bacterial strains exhibited faster growth with the increase of temperature. Six bacterial strains had significantly tardy growth under the condition of low-temperature refrigeration (4 ℃), indicating that low-temperature storage could inhibit bacterial growth and is suitable for the extension of shelf-life time. Seven bacterial strains had protease activity,Micrococcus luteus and Photobacterium angustum could not decompose starch, and all bacterial strains could not decompose ester. These bacterial strains could grow in the temperature range of 4 － 35 ℃ with the optimal temperature of 35 ℃, in the pH range of 5.0－9.0 with the optimal pH of 7.0, in the NaCl concentration range of 3%－7% with the optimal concentration of 3%.

salted mudsnail；crab paste；bacterial automatic identification；16S rRNA；PCR amplification

S984

A

1002-6630(2011)05-0217-04

2010-10-09

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)(nycy-47)；浙江省重中之重學(xué)科資助項(xiàng)目(XK0613040)；

浙江省教育廳重點(diǎn)資助項(xiàng)目(200517011)

黃鍵(1988—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：hj8862@126.com

*通信作者：蘇秀榕(1956—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)、食品安全、生化與分子生物學(xué)。

E-m

ail：suxiurong@gmail.com