李文靜，尚永彪,2,*，夏楊毅,2

(1.西南大學食品科學學院，重慶 400716；2.重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400716)

糖基化反應改進肌原纖維蛋白質功能特性的研究進展

李文靜1，尚永彪1,2,*，夏楊毅1,2

(1.西南大學食品科學學院，重慶 400716；2.重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400716)

肌原纖維蛋白是肌肉中具有重要功能性質的一類蛋白質，肌原纖維蛋白的功能性質對食品的保水性、質構特性及感官品質具有重要的影響。糖基化反應是蛋白質改性的一種有效方法，具有一定的應用前景。文章綜述肌原纖維蛋白與還原糖進行糖基化反應的機理與方法，糖基化反應對肌原纖維蛋白的溶解性、乳化性、熱穩(wěn)定性等特性的改善效果，并提出了今后的研究方向。

肌原纖維蛋白質；糖基化改性；功能特性

蛋白質改性就是用生化因素(如化學試劑、酶制劑等)或物理因素(如熱、射線、機械振蕩等)使蛋白質的氨基酸殘基和多肽鏈發(fā)生某種變化，引起蛋白大分子空間結構和理化性質的改變，從而獲得較好功能特性和營養(yǎng)特性的蛋白質的技術[1]。蛋白質改性的方法有化學法和酶法，常用的化學改性方法有：酸堿或鹽作用下的改性、磷酸化改性、酰基化改性、糖基化改性、脫酰胺改性等；常用的酶法改性方法有：蛋白酶水解、胃合蛋白反應、酶法蛋白質交聯(lián)等[2-11]。

肌原纖維蛋白(myofibrillar proteins，MP)是一類具有重要生物學功能特性的鹽溶性結構蛋白群，在肌肉蛋白質中占到55%左右，主要包括肌球蛋白、肌動蛋白、肌動球蛋白、原肌球蛋白等。肌原纖維蛋白除在活體中參與肌肉的收縮、在胴體中影響肉的嫩度外，還與肉制品的功能特性，如流變學特性、保水性、乳化性等有密切關系，直接影響動物性食品的產(chǎn)量、質構、黏著力、保油性及保水性[12]。

肌原纖維蛋白可與各類還原糖發(fā)生糖基化反應，新生成的蛋白質在功能特性上會發(fā)生一定的變化。目前，國內外對于肌原纖維蛋白的糖基化研究還處于起步階段，研究的對象也主要是魚肉肌原纖維蛋白。研究表明，糖基化反應可使蛋白質的乳化性、溶解性、熱穩(wěn)定性等功能特性得到改善。而營養(yǎng)學和毒理學方面研究表明，通過糖基化的作用，魚肉蛋白的過敏反應特性在一定程度上得到抑制。因為糖基化反應利用賴氨酸，所以賴氨酸有少量損失，但對其他氨基酸基本沒有影響。由此看來，肌原纖維蛋白的糖基化具有重要的理論意義，在實踐上也具有一定的應用前景。本文對糖基化反應改進肌原纖維蛋白質功能特性的研究進展進行綜述，旨在為今后的相關研究提供參考。

1 糖基化反應機理與方法

1.1 反應機理

糖基化作用(glycosylation)就是將碳水化合物以共價鍵與蛋白質分子上的α-或ε-氨基相連接而形成糖基化蛋白的化學反應[13]，反應分為初始階段、中間階段和最后階段共三個階段[14-15]，其原理與美拉德反應相同(圖 1)。

圖1 美拉德反應線路圖[16]Fig.1 Maillard reaction route map

1.1.1 初始階段

在pH4～9時，糖類的羰基和蛋白質的氨基可發(fā)生反應縮合成羰胺化合物，然后產(chǎn)物脫去一分子水生成希夫堿(Schiff base)，再經(jīng)環(huán)化形成相應的N-取代醛糖基胺，N-取代醛糖基胺在酸的催化下經(jīng)Amadori和Heyns重排形成Amadori或Heyns化合物。

1.1.2 中間階段

當pH＜7時，Amadori重排產(chǎn)物主要進行1,2-烯醇化反應，脫水、脫氨最后生成羥甲基糠醛(hydroxyl methyl furfural，HMF)；當pH≥7時存在兩個反應：一是發(fā)生2,3-烯醇化形成還原酮(reductones)和二羰基化合物，還原酮類化學性質活潑，可進一步脫水再與胺類縮合，或者本身發(fā)生裂解成較小分子如二乙酰、乙酸、丙酮醛等；二是繼續(xù)裂解反應生成含羰基或雙羰基化合物以進行最后階段反應，或在二羰基化合物的存在下與氨基酸發(fā)生脫羧、脫氨作用，成為少一個碳的醛，氨基轉移到二羰基化合物上，這一反應為Strecker降解反應。這一反應生成的羰氨類化合物經(jīng)過縮合，生成吡嗪類物質。

1.1.3 最后階段

此階段反應相當復雜、其反應機制尚不清楚，主要是中間階段產(chǎn)物與氨基化合物進行醛基-氨基反應最終形成糖化聚合體-糖基化蛋白(glycosylated protein)。

1.2 反應方法

1.2.1 肌原纖維蛋白的提取

不同的肌原纖維蛋白其提取方法有所不同。魚肉肌原纖維蛋白的提取方法可根據(jù)Saeki[17]的方法進行：取魚肉的白色肌肉組織，切碎后在3倍于肌肉體積的50mmol/L NaCl、質量分數(shù)為0.5%的Triton X-100溶液中漂洗10min，傾去懸浮物。將漂洗后的碎肉浸在8倍肌肉體積的50mmol/L NaCl、質量分數(shù)0.5% Triton X-100溶液中，用高速組織搗碎機12000r/min勻漿2min，用棉紗布過濾除去結締組織，8000r/min冷凍離心10min，取沉淀物，再經(jīng)50mmol/L NaCl溶液漂洗，8000r/min冷凍離心10min，反復進行4次，獲得較純的肌原纖維蛋白。所有操作均在8℃以下進行。

1.2.2 肌原纖維糖蛋白的制備

肌原纖維蛋白制備的一般流程：先將肌原纖維溶解，按比例加入還原糖混合，經(jīng)過冷凍干燥，稱取一定量的凍干粉混合物在一定的條件下進行糖基化反應。

魚類肌原纖維糖蛋白的制備方法[18]：將肌原纖維蛋白分散在50mmol/L NaCl溶液中，使其最終質量濃度為6mg/mL，加入還原糖，進行冷凍干燥，－60℃冷凍干燥24h，凍干粉在－20℃凍藏。稱取一定量的凍干粉混合物進行糖基化反應，糖基化反應在一定的溫度、相對濕度和時間下進行。

糖基化反應時，常用的糖基供體主要有葡萄糖、葡聚糖、海藻低聚糖、乳糖、低聚異麥芽糖等[16]。不同的糖基供體對反應的條件要求也會有所不同，對肌原纖維蛋白各功能性質的改善效果也會有差異。葡萄糖和海藻低聚糖通過糖基化反應可以提高肌原纖維蛋白在低離子強度溶液中的溶解性和乳化性。葡聚糖可以改善肌原纖維的乳化性。

每一種糖基供體與肌原纖維蛋白進行糖基化反應時，都有最佳的質量比例，一般情況下糖比例越高，反應進行得越快，糖比例的變化對肌原纖維蛋白的溶解性、乳化性和熱穩(wěn)定性等功能特性的改善效果也有影響。隨著糖基化反應進行的程度不同，其功能特性提高的程度也會有差異。

2 糖基化反應對肌原纖維蛋白功能性質的改進效果

肌原纖維蛋白由多種蛋白質組成，其中主要是肌球蛋白(相對分子質量約為50萬～60萬)和肌動蛋白(相對分子質量約為4.2萬)。肌原纖維有良好的凝膠、保水等功能特性。但是當肌原纖維蛋白在應用中發(fā)生變性時，其功能特性也很快降低。通過糖基化反應，使肌原纖維與糖類結合生成新的糖蛋白。新合成的糖蛋白在溶解性、乳化性、熱穩(wěn)定性等功能特性方面都有不同程度的提高。

2.1 溶解性

Katayama等[19-20]用魚肉肌原纖維蛋白質與葡萄糖以質量比1:18混合，經(jīng)過冷凍干燥后在溫度50℃、相對濕度5%～95%條件下進行糖基化反應。結果表明，相對濕度5%和35%時的反應產(chǎn)物在0.1mol/L NaCl溶液中的溶解性可顯著提高，接近未糖基化的蛋白在0.5mol/L NaCl溶液中溶解性。但相對濕度65%時的反應產(chǎn)物在0.1mol/L NaCl溶液中的溶解性會減弱，相對濕度達到95%時其溶解性幾乎喪失。因此，糖基化反應可改變肌原纖維在低離子強度下的溶解性，且相對濕度和葡萄糖濃度是影響肌球蛋白熱變性的重要因素。實驗還證明，糖基化改善肌原纖維的溶解性是因為肌球蛋白的成絲能力隨著糖基化反應的進行而減弱，從而使其水溶性增加。

Saeki等[17,21]和Manabu等[22]對鯉魚的肌原纖維蛋白進行了糖基化改性研究。以質量比1:9混合鯉魚的肌原纖維蛋白與葡萄糖，經(jīng)過冷凍干燥后，在溫度40℃(0～24h)、50℃(0～12h)、60℃(0～6h)，相對濕度 65% 的條件下反應。結果表明，糖基化后肌原纖維蛋白在低離子強度溶液中的溶解性有顯著提高，40℃糖基化反應進行12h后，在0.1mol/L NaCl溶液中，糖基化蛋白質的溶解性最高可達到63%，而未經(jīng)糖基化的蛋白質在同樣的溶液中溶解度只能達到11%。Sato等[23-24]以海藻多糖(alginate oligosaccharide，AO)為糖基供體對鯉魚肌原纖維蛋白的功能特性進行改善，鯉魚肌原纖維蛋白與海藻多糖按一定比例混合，經(jīng)過冷凍干燥后，在溫度40℃，相對濕度65%的條件下反應。結果表明，鯉魚肌原纖維海藻多糖蛋白在低離子強度溶液中溶解性有很大提高，溶解性隨著反應時間的延長逐漸提高，并且生成的糖蛋白在80℃加熱2h溶解度也幾乎沒有改變。此外，糖蛋白中的賴氨酸含量沒有明顯減少。

Hirofumi等[25]將糖基化技術運用到冰凍大馬哈魚魚肉蛋白功能特性的改進研究上，將大馬哈魚魚肉蛋白與海藻多糖混合，一定條件下凍干后，在溫度60℃和相對濕度5%～95%的條件下反應。結果表明，大馬哈魚魚肉蛋白通過糖基化改性后其溶解性顯著增強。

Katayama等[26-27]進一步研究發(fā)現(xiàn)魚肉蛋白質與還原糖發(fā)生糖基化反應，該反應抑制了肌動蛋白形成肌原纖維纖絲的能力，從而提高其在低離子強度下的溶解性。研究還發(fā)現(xiàn)鯉魚和貝類肌肉蛋白質在糖基化反應中分別有效利用了賴氨酸。鯉魚肌原纖維蛋白與還原糖發(fā)生糖基化反應時，當糖蛋白中賴氨酸含量為69%，肌動蛋白的等電點從4.98降到4.17時，糖蛋白溶解度可達到97%；貝類肌原纖維蛋白經(jīng)糖基化改性后生成的糖蛋白賴氨酸含量為73%時，肌動蛋白的等電點從5.03降到4.29，其溶解度達到83%。

國內學者對鰱魚肌原纖維蛋白進行了糖基化改善研究。蘆晶等[28]研究了鰱魚肌原纖維蛋白與乳糖糖基化反應條件(乳糖與肌原纖維蛋白質量比、溫度、反應時間)對肌原纖維乳糖蛋白溶解性的影響。結果表明，通過糖基化反應改善了鰱魚肌原纖維蛋白的溶解性，溫度和反應時間對肌原纖維蛋白溶解性的影響比乳糖與肌原纖維蛋白質量比對其的影響大。改善溶解性的最優(yōu)條件是乳糖與鰱魚肌原纖維質量比為1.5:1，溫度50℃，反應時間18.5h。

尤娟等[29]分別以質量比4:1、2:1、1:1、1:2將低聚異麥芽糖與鰱魚肌原纖維蛋白混合，經(jīng)過冷凍干燥后，在溫度55℃、相對濕度79%的條件下進行糖基化反應，結果表明：低聚麥芽糖對改善鰱魚肌原纖維蛋白溶解性的作用不顯著，當?shù)途埯溠刻桥c鰱魚蛋白的混合質量比為4:1時，制備的糖蛋白的溶解性最高，在0.1mol/L NaCl溶液中溶解度為10%。

2.2 乳化性

Saeki等[17,21]對糖基化鯉魚肌原纖維蛋白與鯉魚肌原纖維蛋白的乳化特性進行比較，鯉魚的肌原纖維蛋白在乳化后其乳化混濁度很快就會下降，在8min內就出現(xiàn)明顯的油層，而糖基化鯉魚肌原纖維蛋白乳化后在60min時仍保持較高的混濁度，且沒有油層出現(xiàn)。鯉魚肌原纖維蛋白的乳化穩(wěn)定性通過糖基化反應可提高2～4倍。Sato等[23-24]研究發(fā)現(xiàn)，鯉魚肌原纖維蛋白與海藻多糖發(fā)生糖基化反應，生成的糖蛋白的乳化性得到提高，即使在接近等電點時仍然保持較高的乳化性。

蘆晶等[28]用乳糖改善鰱魚肌原纖維的乳化活性，改性后的鰱魚肌原纖維蛋白乳化活性有了很大的提高，實驗得出最優(yōu)條件是乳糖與鰱魚肌原纖維蛋白質量比為2.15:1，溫度50℃，反應時間18.5h。尤娟等[29]研究發(fā)現(xiàn)鰱魚肌原纖維的乳化活性比較低，但乳化穩(wěn)定性較好，經(jīng)糖基化反應后乳化活性得到顯著提高。反應產(chǎn)物的乳化性受糖與蛋白的比例的影響較小。

Fujiwara等[30]將葡聚糖與鯉魚肌原纖維蛋白以質量比9:1混合，經(jīng)冷凍干燥后，在40、50℃，相對濕度65%的條件下發(fā)生糖基化反應，改性后的鯉魚肌原纖維蛋白乳化性得到很大提高，且其乳化特性在經(jīng)過50℃熱處理后仍未被破壞。

2.3 熱穩(wěn)定性

鰱魚肌原纖維蛋白的熱穩(wěn)定性比較好，糖基化反應使蛋白的熱穩(wěn)定性進一步提高。蘆晶等[28]研究了鰱魚肌原纖維蛋白與乳糖糖基化產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性，結果表明，生成的糖蛋白在經(jīng)過熱處理后，熱穩(wěn)定性(熱處理前后未變性蛋白質的質量比)仍可達到75%。改善鰱魚肌原纖維蛋白熱穩(wěn)定性的最優(yōu)條件是乳糖與肌原纖維蛋白質量比為1.5:1、溫度55℃、反應時間13h。尤娟等[29]對鰱魚肌原纖維蛋白與低聚異麥芽糖反應生成的糖蛋白的熱穩(wěn)定性進行了研究，結果表明，生成的糖蛋白在經(jīng)過熱處理后，其熱穩(wěn)定性可達到95%以上。

Fujiwara等[30]對鯉魚肌原纖維與葡聚糖發(fā)生糖基化反應產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性進行了研究，結果表明，生成的糖蛋白熱穩(wěn)定性有很大提高，其乳狀液的熱穩(wěn)定性在經(jīng)過50℃熱處理后，其性能仍未改變。

3 結 語

前人的研究表明，經(jīng)過糖基化反應改性后，魚肉肌原纖維蛋白在低離子強度溶液中的溶解性、乳化性及熱穩(wěn)定性等功能性質有大幅度的提高，可以用來改善動物性食品的品質；糖基化反應過程很復雜，反應條件也對肌原纖維蛋白質各功能特性的改善效果產(chǎn)生影響，故在對肌原纖維進行糖基化改性時，應根據(jù)加工需要選擇適宜的反應條件。

糖基化反應是改變肌原纖維蛋白性質的一種有效方法，具有一定的應用價值。但是，由于肌原纖維蛋白的糖基化研究還處于起步階段，此方法的理論研究與肉類產(chǎn)品生產(chǎn)中的實際應用還有相當?shù)木嚯x。如何合理選擇糖基供體及確定糖基化反應條件，提高改性后的肌原纖維蛋白的應用價值，如何將改進技術應用于肉制品的加工生產(chǎn)等問題將是今后需要研究的主要方向。

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Research Progress in Functional Property Improvement of Myofibrillar Proteins by Glycosylation

LI Wen-jing1，SHANG Yong-biao1,2,*，XIA Yang-yi1,2
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400716, China；2. Chongqing Special Food Programme and Technology Research Center, Chongqing 400716, China)

Myofibrillar proteins are a kind of proteins, which reveal an important effect on water-holding capacity, texture properties and sensor quality of foods due to the functional properties of myofibrillar proteins. Glycosylation is an effective method to modify proteins, which have a wide range of application prospects. In this paper, the mechanisms and methods of glycosylation reaction between myofibrillar proteins and reducing sugars, and enhanced effect of glycosylation on solubility,emulsion and thermal stability have been reviewed. The future research directions have also proposed.

myofibrillar protein；glycosylation modification；functional property

TS251.1

A

1002-6630(2011)05-0306-04

2010-07-04

重慶市科技攻關項目(CSTC2010AC1008)；西南大學博士基金項目(SWU110008)；

重慶市特色食品工程技術研究中心項目

李文靜(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為畜產(chǎn)品加工。E-mail：lwj-18@163.com

*通信作者：尚永彪(1964—)，男，副教授，博士，研究方向為畜產(chǎn)品加工。E-mail：shangyb@sohu.com