范媛媛，鄭 冰，王樹(shù)祥，楊公明

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642;2.順德出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東順德 528303)

一種新型培養(yǎng)基在沙門(mén)氏菌檢測(cè)中的效果評(píng)價(jià)

范媛媛1，2，鄭 冰2，王樹(shù)祥2，楊公明1，*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642;2.順德出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東順德 528303)

目的:評(píng)價(jià)一種新型的SX2液體培養(yǎng)基對(duì)沙門(mén)氏菌的增菌效果。方法:對(duì)目標(biāo)菌株的靈敏度、生長(zhǎng)率、選擇性及生化反應(yīng)等幾個(gè)方面進(jìn)行測(cè)試，根據(jù)測(cè)試結(jié)果來(lái)判斷新型培養(yǎng)基的增菌效果。結(jié)果:新型培養(yǎng)基與國(guó)標(biāo)推薦方法中使用的培養(yǎng)基的增菌效果相當(dāng)。結(jié)論:此液體培養(yǎng)基可以作為沙門(mén)氏菌的快速檢測(cè)用增菌液。

沙門(mén)氏菌，培養(yǎng)基，檢測(cè)

沙門(mén)氏菌是人和動(dòng)物的重要致病菌，是引起食物中毒的主要病原菌之一［1］，沙門(mén)氏菌作為食源性感染致病菌目前在世界各國(guó)還排列在細(xì)菌食物中毒的首位［2］。世界衛(wèi)生組織十分明確地規(guī)定了沙門(mén)菌屬于食品衛(wèi)生必檢項(xiàng)目之一。食品原料、飼料的運(yùn)輸、加工生產(chǎn)過(guò)程都會(huì)因引進(jìn)沙門(mén)氏菌而造成污染，沙門(mén)氏菌的污染已對(duì)食品安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅［3］。因此準(zhǔn)確地檢測(cè)食品及飼料中沙門(mén)氏菌，對(duì)預(yù)防疾病、提高畜禽產(chǎn)品質(zhì)量，保護(hù)人類(lèi)身體健康都具有十分重要的意義。食品中沙門(mén)氏菌的國(guó)家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)已沿用多年，但由于其操作繁瑣、工作量大、耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)等不足，無(wú)法滿(mǎn)足快速檢測(cè)的需要。因此，研究者對(duì)傳統(tǒng)的沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法和檢測(cè)方法中的培養(yǎng)基都進(jìn)行了不斷改進(jìn)，以期得到快速可靠的檢測(cè)方法。AFNOR改良法是法國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)新推出的一種檢測(cè)方法，此檢測(cè)方法中采用了新型的SX2液體培養(yǎng)基。SX2液體培養(yǎng)基是在傳統(tǒng)方法前增菌的基礎(chǔ)上，改變了選擇性增菌所使用的培養(yǎng)基，由新型的液體培養(yǎng)基SX2取代了國(guó)標(biāo)中的SC、TTB液體培養(yǎng)基，并且培養(yǎng)的溫度和時(shí)間也與國(guó)標(biāo)法不同，分別為41.5℃，培養(yǎng)22～26h。文中針對(duì)SX2液體培養(yǎng)基對(duì)沙門(mén)氏菌的增菌效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鼠傷寒沙門(mén)氏菌CMCC(B)50115、大腸埃希氏菌ATCC25922 BPW、SC增菌液 廣東環(huán)凱生物科技有限公司;VIDAS SLM篩檢條、API 20E、SX2增菌液、RVS增菌液 法國(guó)Bio Mérieux公司;BS瓊脂、XLD瓊脂、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基TSA 北京陸橋技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)條件 使用GB4789.4與AFNOR改良法分別進(jìn)行增菌實(shí)驗(yàn)［4］，國(guó)標(biāo)法中使用的培養(yǎng)基SC為《培養(yǎng)基制備指南》［5］的第二部分中推薦使用的參考培養(yǎng)基，其培養(yǎng)條件為37℃，24h;而AFNOR改良法使用的SX2培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為41.5℃，22～26h。對(duì)比兩種方法的增菌效果。為更好地驗(yàn)證SX2的增菌效果，還選擇了另外一種參考培養(yǎng)基RVS，此培養(yǎng)基在一些國(guó)外標(biāo)準(zhǔn)中也經(jīng)常使用，其培養(yǎng)條件為41.5℃，24h。

1.2.2 菌懸液的制備［5－6］分別取鼠傷寒沙門(mén)氏菌和大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的營(yíng)養(yǎng)瓊脂新鮮培養(yǎng)物少許，于無(wú)菌的生理鹽水中，制成一定濃度的菌懸液。

鼠傷寒沙門(mén)氏菌的菌懸液用無(wú)菌生理鹽水依次從10－1到10－10作連續(xù)10倍遞減稀釋液，備用。同時(shí)取1m L 10－10稀釋度的菌懸液涂布平板，做兩個(gè)平行樣，分別菌落計(jì)數(shù)，取平均值為85cfu。大腸埃希氏菌的菌懸液稀釋后，測(cè)量其濃度為8.0×104cfu/m L。

1.2.3 靈敏度實(shí)驗(yàn) 接種時(shí)，取10－5～10－9稀釋液各0.1m L分別加入SC、RVS、SX2液體培養(yǎng)基中，每一稀釋度接種3管，按相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求的條件培養(yǎng)后，觀察結(jié)果。三分之二或以上管數(shù)呈現(xiàn)生長(zhǎng)(混濁)的最高稀釋度為該培養(yǎng)基的靈敏度［7］。

1.2.4 生長(zhǎng)率實(shí)驗(yàn) 采用定量的方法評(píng)價(jià)培養(yǎng)基的微生物學(xué)性能。取0.1m L的1.2.2中稀釋度為10－9的鼠傷寒沙門(mén)氏菌的菌懸液，接種于SC、SX2液體培養(yǎng)基中;取0.1m L的1.2.2中的大腸埃希氏菌的稀釋菌懸液接種于SC、SX2液體培養(yǎng)基中;再取上述的兩種菌懸液各0.1m L混合后接種于SC、SX2液體培養(yǎng)基中，每步接種都分別做兩個(gè)平行樣。經(jīng)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求的條件培養(yǎng)后，取1m L接種了非目標(biāo)菌的培養(yǎng)液涂布于TSA平板，計(jì)數(shù)菌落總數(shù);再取1m L接種了目標(biāo)菌的培養(yǎng)液、1m L接種了目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌的混合菌培養(yǎng)液的 10－7、10－8、10－9稀釋液，分別涂布接種于TSA平板，選擇適合計(jì)數(shù)的平板，計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。

生長(zhǎng)率PR的計(jì)算公式如下:

式中，PR:生長(zhǎng)率(回收率);NS:從一個(gè)或多個(gè)待測(cè)培養(yǎng)基平板上得到的菌落總數(shù);N0:從一個(gè)或多個(gè)規(guī)定的參考培養(yǎng)基平板上得到的菌落總數(shù)(該菌落總數(shù)應(yīng)≥100cfu)。

參照ISO等標(biāo)準(zhǔn)，非選擇培養(yǎng)基上目標(biāo)菌的生長(zhǎng)率不得低于0.7;選擇性培養(yǎng)基上目標(biāo)菌的生長(zhǎng)率最低應(yīng)為 0.1，非目標(biāo)菌的 SF值至少應(yīng)達(dá)到 2［5－6，8］。

1.2.5 選擇性實(shí)驗(yàn) 采用半定量的方法測(cè)試SX2的選擇性。取1m L的1.2.2中制備的大腸埃希氏菌菌懸液加入SX2肉湯中，接種三個(gè)平行樣，按相關(guān)條件培養(yǎng)。用3mm接種環(huán)取培養(yǎng)物劃平行直線接種于TSA平板，培養(yǎng)后觀察非目標(biāo)菌的生長(zhǎng)情況，根據(jù)非目標(biāo)菌的生長(zhǎng)情況進(jìn)行評(píng)價(jià):非選擇性平板上沒(méi)有菌落生長(zhǎng)或少于10cfu，則表示液體測(cè)試肉湯的選擇性良好。

1.2.6 生化特性測(cè)試 選取1.2.4生長(zhǎng)率實(shí)驗(yàn)中，混合菌用SX2增菌后，在平板TSA上得到的典型菌落，采用API 20E進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

鼠傷寒沙門(mén)氏菌在SC、RVS、SX2液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表1。

表1 鼠傷寒沙門(mén)氏菌在三種液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況

從表1可知，SX2和SC、RVS增菌液的靈敏度均可達(dá)到10－9，因此可以判斷，在檢測(cè)沙門(mén)氏菌時(shí)，SX2增菌液的靈敏度與SC、RVS增菌液的靈敏度相當(dāng)。

2.2 生長(zhǎng)率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分別計(jì)數(shù)各TSA平板后，鼠傷寒沙門(mén)氏菌、大腸埃希氏菌在SC、SX2液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表2。

表2 工作菌株在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況

由表2可見(jiàn)，鼠傷寒沙門(mén)氏菌在SX2增菌液中的生長(zhǎng)率為0.94，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于0.1;而非目標(biāo)菌大腸埃希氏菌的最高濃度為3cfu/m L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于標(biāo)準(zhǔn)要求的濃度104cfu/m L;在混合菌中目標(biāo)菌的生長(zhǎng)未受到非目標(biāo)菌的抑制，始終為優(yōu)勢(shì)菌，其最低濃度為 2.5×108cfu/m L，大于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的最低濃度106cfu/m L。以上各項(xiàng)指標(biāo)表明此培養(yǎng)基對(duì)目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌的培養(yǎng)均符合ISO等培養(yǎng)基標(biāo)準(zhǔn)的要求。

2.3 選擇性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

三個(gè)TSA平板中，兩個(gè)平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)，只有一個(gè)平板上的大腸埃希氏菌菌落為1cfu，小于標(biāo)準(zhǔn)要求的10cfu，則結(jié)果表示，液體測(cè)試肉湯SX2的選擇性良好。

2.4 生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

挑取1.2.4中TSA平板上的菌落進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)菌株為鼠傷寒沙門(mén)氏菌，與標(biāo)準(zhǔn)菌株相符。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，新型的液體培養(yǎng)基SX2能達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求，可以作為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)沙門(mén)氏菌用培養(yǎng)基，并且其檢測(cè)方法與傳統(tǒng)方法相比簡(jiǎn)便、省時(shí)，從前增菌到上機(jī)，只需要48h，如果結(jié)果是陰性，最多耗時(shí)49h就可以出報(bào)告，而且不需要?jiǎng)澠桨濉⒂^察菌落形態(tài)特征;而傳統(tǒng)的方法，得到陰性結(jié)果也要3d。

面對(duì)目前進(jìn)出口貿(mào)易頻繁，檢測(cè)任務(wù)逐漸加重的現(xiàn)狀，簡(jiǎn)便省時(shí)快速的檢測(cè)方法日益受到檢測(cè)機(jī)構(gòu)的青睞。那么如何改進(jìn)方法，提高檢測(cè)效率，就要求從最基本的培養(yǎng)基做起，選擇一種適合的培養(yǎng)基，既能快速促進(jìn)目標(biāo)菌的生長(zhǎng)，又能明顯抑制非目標(biāo)菌的生長(zhǎng)。很多國(guó)家和機(jī)構(gòu)一直在對(duì)培養(yǎng)基的性能進(jìn)行改進(jìn)。

本文所使用的SX2液體培養(yǎng)基就是法國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)新推出的一種沙門(mén)氏菌檢測(cè)方法——AFNOR改良法中所使用的培養(yǎng)基，此AFNOR改良法是法國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)在雙線增菌法、單線增菌法基礎(chǔ)之上建立起來(lái)的新方法，與其他方法的明顯改進(jìn)就是使用了SX2新型培養(yǎng)基。自1994年4月確認(rèn)了VIDAS SLM沙門(mén)氏菌測(cè)試可作用所有人和動(dòng)物食品的沙門(mén)氏菌快速測(cè)試方法后［9］，被一些國(guó)家陸續(xù)采用，1996年5月被AOAC采用［10］，丹麥獸醫(yī)與食品管理局、加拿大公共衛(wèi)生部、英國(guó)、德國(guó)也把VIDAS SLM測(cè)試作為標(biāo)準(zhǔn)方法;而我國(guó)檢測(cè)細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)方法還是傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，所以我們可以借鑒一些國(guó)外方法，提高檢測(cè)效率，或者將國(guó)內(nèi)和國(guó)外的方法相結(jié)合，但陽(yáng)性結(jié)果的樣品必須按國(guó)標(biāo)方法做證實(shí)實(shí)驗(yàn)方可報(bào)告結(jié)果。

［1］賀連華，吳平芳，劉濤.食品中沙門(mén)菌檢驗(yàn)方法的優(yōu)化與應(yīng)用［J］.實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008，15(5):1575－1576.

［2］Cheng CM，Lin W，Van KT，et al.Rapid detection of Salmonella in foods using real－time PCR［J］.Food Prot，2008，71(12):2436－2441.

［3］王耀，鄭秋月，曹際娟.SYBRTMR Green Ⅰ實(shí)時(shí)PCR快速檢測(cè)沙門(mén)氏菌［J］.中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2006，18(4):314－317.［4］吉林省疾病預(yù)防控制中心，河南省疾病預(yù)防控制中心，廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心，等.GB 4789.4－2008，食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門(mén)菌檢驗(yàn)［S］.北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008:1－6.

［5］SN/T 1538.2－2007.培養(yǎng)基制備指南［S］.第 2 部分:培養(yǎng)基性能測(cè)試使用指南.

［6］SN/T 1538.1－2005.培養(yǎng)基制備指南［S］.第 1 部分:實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基制備質(zhì)量保證通則.

［7］中國(guó)生物制品標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì).中國(guó)生物制品規(guī)程(2000年版)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2000.

［8］ISO/TS 11133－2:2003.Microbiology of food and animal feeding stuffs－Guidelines on preparation and production of culture media［S］.Part 2:Practical guideline on performance testing of culturemedia.

［9］Norme ISO6579，Directivesge neralesco ncemant les methodesde re cherchb des Sa lmonella，AFNOR［S］.December，1993，5.

［10］CURIALE，et al.Journal of AOAC［J］.1997，80:469－504.

Application of a new culture media in Salmonella examination

FAN Yuan－yuan1，2，ZHENG Bing2，WANG Shu－xiang2，YANG Gong－m ing1，*
(1.College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China;
2.Entry－exit Inspection and Quarantine Bureau，Shunde 528303，China)

The effectiveness of a new liquid culture media SX2for Salmonella was evaluated.Several aspects，such as sensitivity，productivity，selectivity and biochemicalevents were tested，according to the test results to evaluate the effectiveness.The effectiveness of new liquid culture media was correspondent with routine.Finally，the new liquid culture media may be used as culture media for Salmonella rapid detection.

Salmonella;culture;detection

TS207.4

A

1002－0306(2011)08－0415－03

2010－07－30 *通訊聯(lián)系人

范媛媛(1977－)，女，在讀博士研究生，工程師，研究方向:食品質(zhì)量與安全。