徐麗嫚，黃 曼，涂 世，陳 靜，劉 睿*

(華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，湖北 武漢 430070)

高粱原花青素的E S I-MS分析及其低聚體的R P-HP L C-MS/MS法分離鑒定

徐麗嫚，黃 曼，涂 世，陳 靜，劉 睿*

(華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，湖北 武漢 430070)

以高粱加工后的副產(chǎn)物——高粱外種皮為原料，采用電子噴霧離子化質(zhì)譜(electrospray ionization-mass spectroscopy，ESI-MS)對ADS-17大孔樹脂純化的高純度高粱原花青素(sorghum procyanidins，SPC)的組成進行分析，并通過反相高效液相色譜(reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC)-質(zhì)譜(RP-HPLCMS/MS)聯(lián)用對Toyopearl HW-40凝膠色譜分離的SPC-5級分進行分離鑒定。結(jié)果顯示：SPC為低聚體原花青素，包含有兒茶素/表兒茶素單體、原花青素二～六聚體；SPC-5由8種三聚體和1種二聚體組成。

高粱原花青素；凝膠色譜；電子噴霧離子化質(zhì)譜(ESI-MS)；反相高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(RP-HPLC-ESIMS/MS)；鑒定

reverse phase high-performance liquid chromatography-mass spectroscopy/mass spectroscopy (RP-HPLC-ESI- MS/MS)；identification

原花青素(proanthocyanidins，PC)是植物中廣泛存在的一類屬于雙黃酮衍生物的天然多酚化合物，這類物質(zhì)在酸性介質(zhì)中加熱，可降解和氧化產(chǎn)生紅色花青素(cyanidins)，故稱為原花青素[1]。原花青素由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素結(jié)合而成，平均聚合度(degree of polymerization，DP)范圍為2～15，平均分子質(zhì)量為578～＞5000u，最簡單的是兒茶素、表兒茶素或兒茶素與表兒茶素形成的二聚體，此外還有三聚體、四聚體等直至十聚體。根據(jù)聚合度的大小，通常將二～四聚體稱為低聚體(proanthocyanidolic oligomers，OPC)，將五聚體以上的稱為高聚體(p roa n th ocya n idolic polymers，PPC)。

隨著原花青素與蛋白質(zhì)、微生物、酶的反應活性及抗氧化、清除自由基等一系列化學反應機理被不斷揭示，該類天然產(chǎn)物應用前景逐漸廣闊，其中原花青素預防齲齒的作用引起越來越多的關(guān)注[2]，但研究還處于起步階段，現(xiàn)有研究主要是采用提取液(混合物)或簡單分級的級分進行，因此原花青素的分離和鑒定成為研究重點。原花青素的分離、純化方法包括膜過濾或超濾、反滲透、溶劑萃取及色譜法等，其中色譜法是目前采用最多的方法。原花青素的柱色譜分離在色譜填料的選擇上主要有 NKA[3]、ADS-17[4]、Toyopearl HW-40[5]、Sephadex LH-20[6-7]、PVP、HPLC-C18[4]、硅膠柱及聚酰胺等。原花青素的定性定量分析包括比色法和色譜法，結(jié)構(gòu)表征主要采用HPLC-MS[8-10]、圓二色譜(circular dichroism，CD)[11]、核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)[11-12]等。

我國高粱的栽培面積居世界第5位，產(chǎn)量居世界第3位，高粱外種皮中富含原花青素，這一富含原花青素資源未被有效利用。本研究擬采用乙醇溶液進行提取，通過ADS-17大孔樹脂進行純化獲得目標產(chǎn)物高粱原花青素，通過Toyopearl HW-40凝膠色譜進行分離，結(jié)合質(zhì)譜(mass spectroscopy，MS)和反相高效液相色譜(reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC)-質(zhì)譜聯(lián)用(RP-HPLC-MS/MS)對高粱原花青素(sorghum procyanidins，SPC)和凝膠色譜分離的級分進行分離鑒定，為進一步探討高粱原花青素分子質(zhì)量大小及其組成與預防齲齒功效的關(guān)系建立研究方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高粱產(chǎn)于東北地區(qū)，干燥保存。

9 5%乙醇、鹽酸、偏磷酸、亞硫酸氫鈉、甲醇皆為AR級；乙腈、冰乙酸皆為HPLC級；Toyopearl HW-40(S)凝膠 日本Tosoh公司；ADS-17大孔樹脂 天津南開和成科技有限公司。

1.2 儀器與設備

檢驗碾米機 浙江臺州市糧儀廠；RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮有限公司；BETA2-8LD真空冷凍干燥機 美國Christ公司；BSZ-100自動部分收集器 上海滬西分析儀器廠；1100液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；紫外-可見分光光度計 日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 高粱外種皮原花青素的提取[13]

取一定質(zhì)量的高粱，用檢驗碾米機碾磨和過篩(40目)后，得到高粱外種皮粉末。將粉末置于1000mL燒杯中，按照1:12(m/V)的料液比加入70%乙醇溶液、0.1g/100mL偏磷酸溶液、0.5g/100mL亞硫酸氫鈉溶液，混勻，然后用薄膜封口后，放入80℃的水浴鍋中直接加熱90min，最后經(jīng)過減壓抽濾得到上清液。提取3次，將3次提取的上清液合并，真空濃縮得到SPC提取液。

1.3.2 SPC提取物的純化

將預處理好的ADS-17大孔樹脂裝于玻璃層析柱(32cm×5cm)中，裝柱過程中避免氣泡產(chǎn)生。加入一定量的SPC提取液，先用10倍柱床體積的蒸餾水沖洗，直至流出液基本無色，去除水溶性的雜質(zhì)。然后用40%乙醇溶液進行洗脫，從洗出顏色開始接收，至無色停止接收，最后用蒸餾水洗出乙醇。接收洗脫液真空濃縮，冷凍干燥得到SPC粉末，并計算得率。

測量SPC粉末純度的方法采用鹽酸-正丁醇法(Porter’s方法)[14]。按下列經(jīng)驗公式計算原花青素純度。

PC純度/%＝A÷(C×0.366÷7.2)

式中：C為原花青素質(zhì)量濃度/(mg/mL)；A為波長546nm處的吸光度。

1.3.3 SPC的ESI-MS分析

稱取凍干SPC粉末5mg，溶于5mL甲醇中，通過0.45μm濾膜過濾。將濾液通過直接進樣模式進行MS分析。

MS分析條件：負離子模式，離子化方式為ESI-；掃描范圍為50～2000m/z；干燥氣溫度為350℃，干燥氣流速為10L/min；噴霧壓力為40psi；毛細管電壓為3500V。

1.3.4 SPC凝膠色譜分離

稱取0.1g SPC粉末，溶解于1mL甲醇中，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾。將濾液上樣至Toyopearl HW-40凝膠柱(42cm×2cm)。以甲醇為流動相進行洗脫，流速為0.8mL/min，并用部分收集器進行收集，每10min收集一管，洗脫時間12h左右。最后用甲醇平衡色譜柱。每管接收液通過紫外掃描判定其物質(zhì)類型，并記錄每管在280nm波長處的吸光度，以管數(shù)為橫坐標、吸光度為縱坐標作圖。根據(jù)洗脫曲線，將相應部分合并、濃縮、凍干，得到各個級分的凍干粉末。

1.3.5 SPC-5級分的HPLC-MS/MS分析

稱取凍干后凝膠色譜分離的SPC-5級分粉末5mg，溶于5mL甲醇中，通過0.45μm濾膜過濾，待進樣。

HPLC-MS/MS分析條件：色譜柱為Symmetry C18(4.6mm×150mm)；質(zhì)譜進樣分流比為1:3；進樣量為20μL；負離子模式，離子化方式為ESI-；掃描范圍為50～2200m/z；干燥氣溫度為350℃，干燥氣流速為10L/min；噴霧壓力為40psi；毛細管電壓為3000V；PDA檢測波長為280nm；柱溫為35℃。流動相A為0.5%冰乙酸、B為乙腈；流速為1mL/min；梯度洗脫程序為：B在0min→18min由6%增大到25%，18min→20min由25%增大到60%，20min→25min為60%，25min→27min由60%減小到6%，27min→30min為6%。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPC的提取及純化

采用乙醇溶液提取高粱外種皮中的原花青素，ADS-17大孔樹脂純化后產(chǎn)物的得率為2.2%，經(jīng)正丁醇-鹽酸法測得純化后原花青素的純度為97.4%。

2.2 SPC的MS分析

圖1 SPC全范圍掃描質(zhì)譜圖Fig.1 Full scan negative ionisation mass spectrum of procyanidins extracted from sorghum episperm

ESI是一種軟電離方式，它通常沒有碎片離子峰，只有整體的分子離子峰，易于得到樣品的分子質(zhì)量信息。圖1顯示了含有m/z577.19、865.19、1153.22、1441.28、1730.20的分子離子，它們分別對應原花青素的二聚體(相對分子質(zhì)量：578)、三聚體(相對分子質(zhì)量：866)、四聚體(相對分子質(zhì)量：1154)、五聚體(相對分子質(zhì)量：1442)和六聚體(相對分子質(zhì)量：1731)的分子離子峰(MH)－，同時也含有m/z285.28，它是由相對分子質(zhì)量為289的兒茶素或表兒茶素脫去4個H+得到的。Jan等[15]在用反相高效液相色潽及電子噴霧離子化質(zhì)譜研究巧克力中原花青素時，得到了m/z289.3、577.3、865.3、1153.2、1441.2、1729.1等原花青素準分子離子峰。Christian等[16]也曾證明了高粱中含有原花青素的四～九聚體，與本研究結(jié)果相似，因此可以初步判斷純化后SPC成分為二～六聚體的原花青素。

2.3 SPC凝膠色譜分離

由圖2可知，部分收集接受每管可以通過紫外掃描初步判斷其物質(zhì)類型。原花青素的特征吸收光譜除了200nm附近苯環(huán)的E帶吸收外，在紫外區(qū)主要以一個單峰的形式出現(xiàn)，其λmax在280nm附近；而黃酮類物質(zhì)除上述特征外，其在350nm左右有個吸收峰。根據(jù)圖2凝膠色譜分離結(jié)果可以將接收溶液分為1、2、3、4、5五個部分，依次標記為SPC-1、SPC-2、SPC-3、SPC-4、SPC-5，通過紫外掃描后可判斷出SPC-1為平衡柱子后殘留的溶液，SPC-2疑為黃酮類化合物，SPC-3、SPC-4和SPC-5為凝膠色譜分離SPC的3個原花青素級分。

圖2 SPC的Toyopearl HW-40凝膠色譜分離圖Fig.2 Chromatogram of SPC on Toyopearl HW-40 resin column

2.4 SPC-5級分的HPLC-MS/MS分析

圖3 SPC-5的HPLC-MS分析中的色譜圖Fig.3 HPLC-MS chromatogram of SPC-5

從圖3可以看出，在所采用的色譜條件梯度洗脫下，SPC-5中的主要物質(zhì)能夠分開。

圖4 不同保留時間的質(zhì)譜圖(A)及主要分子離子的二級質(zhì)譜圖(B)Fig.4 Mass and MS-MS spectra at each retention time

從圖4可以看出，當保留時間為1.7、2.3、7.7、8.7、10.2、10.7、11.4、14.7min時出現(xiàn)的分子離子均為m/z865.2，其主要的碎片離子是m/z847.3(M－18)、739.2(M－126)、711.2(M－152-2H)、695.2(M－152－18)、577.2(M－288)、575.2(M－288－2H)、451.2(M－288－126－2H)、407.1(M－288－152－18)、289.1(M－576)、287(M －577－2H)。

由表1可知，m/z575.2、289.1、287.0均由QM cleavage分子間的斷裂產(chǎn)生；m/z847.3是通過失去一分子水產(chǎn)生的；m/z2739.2、451.1是通過HRF反應失去一分子間苯三酚得到的；m/z695.2和m/z407.1由RDA反應產(chǎn)生，m/z695.2為發(fā)生RDA反應后失去一分子水產(chǎn)生。此結(jié)果與Falleh等[17]研究松葉菊屬的植物中原花青素三聚體碎片離子(m/z847、695、739、577、425、289)及Karonen等[10]的研究結(jié)果相符合，說明SPC-5主要是原花青素的三聚體，可見在所采用的凝膠色譜分離條件下，將原花青素三聚體從SPC混合物中有效分離出來。HPLC-MS/MS分析結(jié)果顯示，所采用的梯度洗脫條件能有效的將原花青素三聚體的8個異構(gòu)體分離。

表 1 原花青素三聚體(m/z 865，即[M－H]-)在二級質(zhì)譜中的主要分子離子Table 1 Major molecular ions of procyanidin trimer (m/z 865 [MCH]-) in MS-MS spectra

此外，圖4中保留時間為8.1min的MS中的分子離子m/z576.4為原花青素二聚體以及MS/MS中的主要碎片離子m/z407.1(M－152－18)、289.1(M－288)。其中m/z407.1是通過HRF反應失去一分子間苯三酚，進一步脫水形成，m/z289.1是通過分子間裂解得到的。Karonen等[10]曾研究得出松樹皮中原花青素二聚體的碎片離子為m/z286.9、289.0、407.2、425.2、451.0，樊金玲等[18]研究沙棘籽原花色素發(fā)現(xiàn)二聚體的主要碎片離子為m/z425、407、287、289、451、441、423等，研究的結(jié)果皆與本研究得到的結(jié)果相似，證實SPC-5中的1種二聚體被分開。

3 結(jié) 論

3.1 采用乙醇溶液提取高粱外種皮中的原花青素，ADS-17大孔樹脂純化后產(chǎn)物的得率為2.2%，經(jīng)正丁醇-鹽酸法測得純化后原花青素的純度為97.4%。

3.2 通過MS分析SPC含有兒茶素/表兒茶素單體、原花青素二～六聚體。說明通過ADS-17大孔樹脂純化的目標產(chǎn)物是由聚合度小于6的低聚體組成。證明高粱外種皮可以作為制備高活性低聚原花青素的原料，不僅提高了高粱的經(jīng)濟價值，同時也可以得到大量原花青素廣泛用于醫(yī)療、食品以及日用化學品行業(yè)，也為后期原花青素結(jié)構(gòu)與功效的研究提供理論依據(jù)。

3.3 通過Toyopearl HW-40凝膠色譜，純甲醇作為流動相，流速為0.8mL/min時，SPC混合物能夠得到很好的分離，被分為SPC-1、SPC-2、SPC-3、SPC-4、SPC-5五個部分。HPLC-MS/MS分析結(jié)果顯示SPC-5主要是由8種原花青素三聚體和1種二聚體組成，且級分中的不同異構(gòu)體得到分離。這為進一步研究原花青素分子質(zhì)量大小及組成與預防齲齒效果的關(guān)系提供參考。

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ESI-MS Analysis of Procyanidins from Sorghum Episperm and RP-HPLC-ESI-MS/MS Separation and Identification of Its Oligomers

XU Li-man，HUANG Man，TU Shi，CHEN Jing，LIU Rui*
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

The composition of high-purity procyanidins purified by ADS-17 macroposours resin chromatography from sorghum episperm as a byproduct of sorghum processing was analyzed by electrospray ionization- mass spectroscopy(ESI-MS). Fraction SPC-5 separated from the procyanidins by Toyopearl HW-40 resin chromatography was identified by RP-HPLC-ESI-MS/MS. The high-purity procyanidins were found to be procyanidolic oligomers, including catechin/epicatechin monomers, dimmers, trimers, tetrames, pentamers and hexamers. SPC-5 consisted of 8 trimers and 1 dimmer.

sorghum procyanidins；gel chromatography；electrospray ionization-mass spectroscopy (ESI-MS)；

TS210.9

A

1002-6630(2011)20-0221-05

2011-06-29

華中農(nóng)業(yè)大學優(yōu)碩培植項目/中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項(201010)

徐麗嫚(1987—)，女，碩士，研究方向為食品科學。E-mail：19870906manman@sina.com

*通信作者：劉睿(1969—)，男，副教授，博士，研究方向為功能食品及農(nóng)副產(chǎn)品深加工。E-mail：liurui@mail.hzau.edu.cn