張 超，尹禮國，朱文優(yōu)，李正國

(1.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶400044; 2.宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，發(fā)酵資源與應(yīng)用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓644000)

富硒紅發(fā)夫酵母補(bǔ)料分批培養(yǎng)研究

張 超1，2，尹禮國2，朱文優(yōu)2，李正國1，*

(1.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶400044; 2.宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，發(fā)酵資源與應(yīng)用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓644000)

通過搖床培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，研究了紅發(fā)夫酵母富硒培養(yǎng)的適宜糖濃度和C/N比;通過5L磁力攪拌發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)，探討了在第8～32h之間分四次、七次和連續(xù)補(bǔ)料分批培養(yǎng)對細(xì)胞產(chǎn)量、細(xì)胞色素含量和硒含量的影響;結(jié)果表明，30.0g/L的葡萄糖濃度、C/N=2.7分別是分批培養(yǎng)時適宜的糖濃度和碳氮比，細(xì)胞產(chǎn)量、細(xì)胞色素含量和硒含量分別為14.2g/L、589.7、584.2μg/g;與搖床培養(yǎng)相比較，磁力攪拌發(fā)酵罐中補(bǔ)料分批培養(yǎng)顯著地提高了細(xì)胞產(chǎn)量、細(xì)胞色素含量和硒含量;在補(bǔ)料培養(yǎng)中，連續(xù)補(bǔ)料的結(jié)果優(yōu)于七次補(bǔ)料，七次補(bǔ)料優(yōu)于四次補(bǔ)料;在10L機(jī)械攪拌罐中連續(xù)補(bǔ)料培養(yǎng)時，富硒紅發(fā)夫酵母的細(xì)胞產(chǎn)量、色素含量和硒含量分別為26.7、764.3μg/g和1012.5μg/g。。

紅發(fā)夫酵母，硒，富集，補(bǔ)料培養(yǎng)

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

紅發(fā)夫酵母(Phaffia rhodozyma)，由宜賓學(xué)院發(fā)酵工程與食品科學(xué)研究所提供;保藏培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖20.0，蛋白胨10.0，酵母膏5.0，瓊脂20.0，pH5.0;液體種子培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖20.0，尿素3.0，蛋白胨 5.0，酵母膏 5.0，磷酸二氫鉀 1.0，調(diào)pH4.5;搖瓶培養(yǎng)基(g/L) 尿素12.0，酵母膏5.0，磷酸二氫鉀1.0，亞硒酸鈉10.0mg/L，調(diào)pH4.5，葡萄糖量據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計添加;基本培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖30.0，尿素11.2(C/N=2.7)，磷酸二氫鉀1.0，調(diào)pH4.5。

HZQ-QX控溫?fù)u床 哈東聯(lián)電子;磁力攪拌罐GBCS-5A 鎮(zhèn)江東方;機(jī)械攪拌罐BIOF-2000型上海高機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化與液體菌種制備

1.2.1.1 菌種活化 按無菌要求制備PDA斜面，用接種針挑取少許紅發(fā)夫酵母保藏菌種于斜面上，于28℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2～3d，酵母長成紅色菌落后，置于冰箱中4℃保藏備用。

1.2.1.2 液體菌種制備 50mL無菌液體活化培養(yǎng)基，接入2～3環(huán)斜面菌種，初始pH4.5，28℃，160r/min下?lián)u床培養(yǎng)36h備用。

1.2.1.3 搖床培養(yǎng) 在500mL三角瓶中裝入100mL無菌液體實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基，接入液體菌種10%，初始pH4.5，28℃，160r/min搖床培養(yǎng)進(jìn)行到第8h，一次性添加亞硒酸鈉10mg/L。

1.2.1.4 磁力攪拌罐培養(yǎng) 將約3.0L基本培養(yǎng)基裝入磁力攪拌罐中，121℃滅菌30min，冷卻至28℃，接入10%液體菌種，定體積3.0L，初始pH4.5，通氣量為1.9vvm，28℃培養(yǎng)，植物油消泡。葡萄糖、尿素、亞硒酸鈉溶液分開滅菌后混合均勻，總補(bǔ)料體積500mL?？刂瓶偺菨舛?0.0g/L，C/N=2.7，總亞硒酸鈉用量30.0mg/L。補(bǔ)料按實(shí)驗(yàn)設(shè)計進(jìn)行。

1.2.1.5 機(jī)械攪拌罐培養(yǎng) 將約6.0L基本培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐中，121℃滅菌30min，冷卻至28℃，接入10%液體菌種，定體積6.0L，初始糖濃度30.0g/L，pH4.5，28℃培養(yǎng)，通氣量為 1.9vvm，控制溶解氧40%［12］，植物油消泡，溫度、pH、溶解氧、補(bǔ)料自動控制。葡萄糖、尿素、亞硒酸鈉溶液分開滅菌后混合均勻，控制總糖濃度60.0g/L，C/N=2.7，總亞硒酸鈉用量30.0mg/L，總補(bǔ)料體積1350mL。補(bǔ)料方式按實(shí)驗(yàn)設(shè)計進(jìn)行。

1.2.2 測定方法

1.2.2.1 生物量的測定 細(xì)胞干重測定:取一定體積V(mL)的細(xì)胞培養(yǎng)液于4000r/min的轉(zhuǎn)速下離心15min，去清液，再用50℃蒸餾水洗滌2～3次后，再離心，取菌體置于50℃的干燥箱中干燥至恒重，稱重W (g);細(xì)胞濃度(g/L)=1000W/V。

1.2.2.2 酵母細(xì)胞色素的測定 酸熱破碎-丙酮提取-分光光度測定法［13］。

1.2.2.3 硒含量的測定 采用催化吸光光度法［14］。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖濃度對富硒紅發(fā)夫酵母培養(yǎng)的影響

碳元素作為細(xì)胞組成和產(chǎn)物的主要成分，在微生物培養(yǎng)中作用重要。為了了解葡萄糖濃度對富硒紅發(fā)夫酵母培養(yǎng)的影響，探索適宜的初始糖濃度，設(shè)計了以搖瓶培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在糖濃度分別為20.0、25.0、30.0、35.0、45.0、60.0、75.0g/L的情況下，搖瓶培養(yǎng)72h，分別測定細(xì)胞濃度，細(xì)胞中色素含量、細(xì)胞中硒含量，結(jié)果如圖1所示。

圖1 糖濃度對富硒紅發(fā)夫酵母培養(yǎng)的影響

從圖1中可以看出，糖濃度低于35.0g/L時，隨糖濃度的升高，細(xì)胞濃度、色素含量、硒含量增加;當(dāng)糖濃度中30.0g/L時，色素含量、細(xì)胞中硒含量達(dá)最高。而當(dāng)糖濃度超過35.0g/L時，隨糖濃度的升高，細(xì)胞濃度、細(xì)胞色素含量、硒含量很快降低。分析原因可能與過高的糖濃度(＞35.0g/L)抑制了紅發(fā)夫酵母的生理生化活性、影響其對培養(yǎng)基中物質(zhì)的吸收與利用有關(guān)。因此，培養(yǎng)基中葡萄糖濃度過高，不利于富硒紅發(fā)夫酵母的培養(yǎng)。由質(zhì)量守恒可知，要想獲得高的細(xì)胞濃度需要高糖濃度，由于高濃度糖對細(xì)胞生長存在限制作用，因此，采用分批培養(yǎng)方式，難以提高培養(yǎng)液中富硒紅發(fā)夫酵母的密度。在該實(shí)驗(yàn)中，雖然糖濃度為35.0g/L時，有最高的細(xì)胞濃度值，但由于糖濃度為30.0g/L時，細(xì)胞色素含量(551.3μg/g)和硒含量最高(603.9μg/g)，且有比35.0g/L時有更高的細(xì)胞得率系數(shù)(0.48g細(xì)胞/g葡萄糖＞0.44g細(xì)胞/g葡萄糖)，因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇初始糖濃度為30.0g/L為宜。

2.2 碳氮比對富硒紅發(fā)夫酵母培養(yǎng)的影響

培養(yǎng)基中營養(yǎng)物的比例，會影響菌體按比例、均勻地吸收營養(yǎng)物，從而影響微生物地生長。培養(yǎng)基中碳氮比(C/N)失調(diào)，還會造成環(huán)境酸堿度不穩(wěn)定，影響菌體的生長、產(chǎn)物量及組成［15］。為給高密度培養(yǎng)研究奠定基礎(chǔ)，在初始糖濃度為30.0g/L條件下，按C/N=2.0、2.3、2.5、2.7、3.0、3.5、4.0添加尿素，富硒搖瓶培養(yǎng)72h，測定細(xì)胞濃度、細(xì)胞色素量和硒含量，其結(jié)果如圖2所示。

圖2 C/N對富硒紅發(fā)夫酵母培養(yǎng)的影響

從圖2中可以看出，C/N不超過2.7時，細(xì)胞濃度基本穩(wěn)定在14.15g/L左右，細(xì)胞硒含量基本穩(wěn)定在583.5μg/g左右，但細(xì)胞色素含量由566.2μg/g增加到601.3μg/g;C/N超過2.7后，細(xì)胞濃度、硒含量開始明顯降低，而細(xì)胞色素含量略有提高。分析原因可能與C/N提高、基質(zhì)中氮的量降低，不足以滿足細(xì)胞增殖對氮素的需要，限制了細(xì)胞增殖等有關(guān)。同時，也由于C、N比例失調(diào)，影響了紅發(fā)夫酵母對基質(zhì)中硒的吸收與轉(zhuǎn)化，降低了細(xì)胞中的硒含量。這表明C/N為2.7是紅發(fā)夫酵母富硒培養(yǎng)適宜的碳氮組成。

2.3 不同補(bǔ)料方式對富硒紅發(fā)夫酵母培養(yǎng)的影響

在三個5L磁力攪拌發(fā)酵罐中，在適宜的條件下，培養(yǎng)進(jìn)行到第8h時，分別開始補(bǔ)料，分四次(第8、16、24、32h，125.0mL/次)、七次(第8、12、16、20、24、28、32h，71.4mL/次)、連續(xù)(流量為20.8mL/h)補(bǔ)料三種方式，培養(yǎng)72h，測定細(xì)胞濃度、色素含量、硒含量，其結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同補(bǔ)料方式對富硒紅發(fā)夫酵母培養(yǎng)的影響

從圖3中可以看出，四次、七次和連續(xù)補(bǔ)料時細(xì)胞濃度分別是22.8、24.8、26.0g/L，細(xì)胞色素含量分別為611.7、672.9、756.1μg/g，硒含量分別為 784.3、843.9、1006.4μg/g。通過補(bǔ)料操作，紅發(fā)夫酵母的細(xì)胞濃度、細(xì)胞的色素含量、硒含量比搖瓶培養(yǎng)(14.24、589.7、584.2μg/g)時都有了較大的提高。在補(bǔ)料培養(yǎng)中，隨補(bǔ)料次數(shù)的增加，細(xì)胞濃度、色素含量、硒含量增加，連續(xù)補(bǔ)料的效果最好，其細(xì)胞濃度、細(xì)胞的色素含量、硒含量比七次補(bǔ)料分別提高了4.7%、12.4%和19.3%，比四次補(bǔ)料時分別提高了14.2%、23.6%和28.3%。分析原因，可能由于補(bǔ)料的存在，降低了培養(yǎng)基中初始糖和亞硒酸鈉的濃度，解除了高濃度糖和硒對紅發(fā)夫酵母生長的抑制作用。同時，隨補(bǔ)料次數(shù)的增加，體系中糖濃度、硒濃度等越來越處于較低濃度，使糖和硒對紅發(fā)夫酵母生長和代謝的影響得以降低，因此，連續(xù)補(bǔ)料方式能獲得更高的細(xì)胞濃度、色素含量、硒含量。

2.4 富硒紅發(fā)夫酵母在10L機(jī)械攪拌罐中的培養(yǎng)情況

在10L機(jī)械攪拌罐中，在適宜的條件下，培養(yǎng)進(jìn)行到第8h時，開始連續(xù)補(bǔ)料(流量為56.3mL/h)至第32h，分別在第8、12、16、20、24、28、32、48、72h取樣50mL，測定細(xì)胞濃度、色素含量、硒含量，結(jié)果如圖4所示。

從圖4中可以看出，在連續(xù)補(bǔ)料培養(yǎng)中，紅發(fā)夫酵母富集硒、色素合成與細(xì)胞生長同步進(jìn)行，在培養(yǎng)進(jìn)行到36h前，細(xì)胞生長速率較高，此階段細(xì)胞的色素合成和硒富集的能力也最強(qiáng)，含量提高最顯著;但在培養(yǎng)進(jìn)行到36h后，細(xì)胞濃度達(dá)到26.7g/L，而后幾乎不再增加，此時細(xì)胞色素和硒含量仍有少量增加(它們最高分別可達(dá)到色素含量764.3μg/g，硒含量1012.5μg/g)，但其合成與轉(zhuǎn)化的速度比36h前明顯降低。分析原因可能與停止補(bǔ)料后限制性因子增多、細(xì)胞濃度提高影響了氧的溶解效果等因素有關(guān)。

圖4 富硒紅發(fā)夫酵母在10L罐中的培養(yǎng)情況

3 結(jié)論

3.1 紅發(fā)夫酵母富硒培養(yǎng)時，適宜的葡萄糖濃度為30.0g/L，若糖濃度過高，細(xì)胞的產(chǎn)量反而降低。

3.2 培養(yǎng)基中碳氮比(C/N)影響紅發(fā)夫酵母富硒培養(yǎng)，適宜的C/N是2.7∶1，C/N過高，雖然對細(xì)胞色素含量影響不大，但對細(xì)胞濃度和細(xì)胞的硒含量有較大影響，對提高色素總量和富硒紅發(fā)夫酵母的品質(zhì)不利。

3.3 補(bǔ)料方式對高密度培養(yǎng)有較大影響，連續(xù)補(bǔ)料培養(yǎng)時細(xì)胞濃度、色素含量、硒含量較分次補(bǔ)料顯著提高。在10L機(jī)械攪拌中連續(xù)補(bǔ)料培養(yǎng)時連續(xù)補(bǔ)料，獲得了細(xì)胞濃度26.7g/L，色素含量764.3μg/g，硒含量1012.5μg/g的研究結(jié)果。

雖然連續(xù)補(bǔ)料在一定程度上實(shí)現(xiàn)了富硒紅發(fā)夫酵母高密度培養(yǎng)，提高了細(xì)胞中色素含量、硒含量。但在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，由于糖濃度抑制和培養(yǎng)后期溶氧供給困難，一定程度上限制了細(xì)胞的進(jìn)一步增殖和細(xì)胞收得率的提高。因此，篩選耐受高糖濃度和亞硒酸鈉濃度的紅發(fā)夫酵母，探索提高培養(yǎng)體系中溶解氧濃度的方法是值得進(jìn)一步研究的課題。

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Fed-batch culture of selenium-enriched Phaffia rhodozyma

ZHANG Chao1，2，YIN Li-guo2，ZHU Wen-you2，LI Zheng-guo1，*
(1.College of Bio-engneering，Chongqing University，Chongqing 400044，China; 2.College of Life Science and Food Engineering，Key Laboratory of Fermentation Resource and Application of Institutes of Higher Learning in Sichuan，Yibin University，Yibin 644000，China)

The optimum sugar concentration of selenium-enriched phaffia rhodozyma culture and the ratio of carbon and nitrogen(C/N)were studied through shaking culture，and with four times，seven times and constant fedbatch cultures between 8～32h，the cell yield，cell pigment content and selenium content were explored through 5L magnetic stirring fermentor experiment.The results showed that the optimum sugar concentration(30g/L)，the ratio of carbon and nitrogen(C/N=2.7)were from the batch culture，and the cell yield，pigment content and selenium content were 14.2g/L，589.7μg/g and 584.2μg/g，respectively;the cell yield，cell pigment content and selenium content were improved significantly with fed-batch culture compared with shaking culture;the result was the best with constant fed-batch among the three different fed-batch cultures;the cell yield，pigment content and selenium content were 26.7g/L、764.3μg/g and 1012.5μg/g respectively with constant fed-batch culture in 10L mechanical stirring fermentor.

Phaffia rhodozyma;selenium;enrich;fed-batch culture

TS201.3

A

1002-0306(2011)09-0220-04

我國有72%的縣(市)屬于低硒或缺硒區(qū)［1］，人體缺硒會引發(fā)癌癥、心腦血管疾病、糖尿病、肝病、甲狀腺激素失衡等疾?。?］，因此，補(bǔ)硒具有重要意義。酵母硒因具有易被動物吸收、體內(nèi)可貯存、利用性高、毒性小等特點(diǎn)，一度成為人們研究的重點(diǎn)［3-5］。紅發(fā)夫酵母不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、肝糖，而且還含有天然類胡蘿卜素(蝦青素)［6］。由于硒與其它微量元素(如鋅、銅)、維生素(如胡蘿卜素)等協(xié)同作用能成幾百至幾千倍地清除體內(nèi)代謝廢物——自由基［7］，因此，富硒紅發(fā)夫酵母是營養(yǎng)功能更全面的有機(jī)硒補(bǔ)充劑。富硒紅發(fā)夫酵母搖床培養(yǎng)研究［8］表明，亞硒酸鈉添加量和添加時間對細(xì)胞濃度、細(xì)胞色素含量和硒含量等有明顯影響。因此，探索能克服這些影響因素的途徑是實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)率、高濃度培養(yǎng)目標(biāo)的重要手段。近期關(guān)于富硒酵母的研究主要集中在菌種選育和培養(yǎng)工藝方面。范秀英等［9］采用亞硝基胍處理和生物融合等手段獲得了硒含量達(dá)到2050mg/kg，生物量可達(dá)8.2g/L，有機(jī)硒含量達(dá)到91%以上的結(jié)果。李愛芬等［10］在啤酒酵母對數(shù)生長期，采用流加方式逐漸加入亞硒酸鈉，得到了酵母細(xì)胞中硒濃度達(dá)1200～1900mg/kg的結(jié)果。朱曉立等［11］采用流加培養(yǎng)顯著地促進(jìn)了紅發(fā)夫酵母細(xì)胞生長及蝦青素的合成。為了提高細(xì)胞濃度、細(xì)胞色素含量和硒含量，提高富硒紅發(fā)夫酵母產(chǎn)品的競爭優(yōu)勢，本實(shí)驗(yàn)探索了富硒紅發(fā)夫酵母分批補(bǔ)料培養(yǎng)工藝。

2011-05-23 *通訊聯(lián)系人

張超(1966-)，男，研究生，副教授，主要從事生物工程與食品生物技術(shù)研究。

四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(04JY029-102);宜賓市科技局研究項(xiàng)目(200403021)。