王鳳平,陳 清,吳奎海,俞守義,王 前,芮勇宇＊

(南方醫(yī)科大學(xué)1.南方醫(yī)院檢驗(yàn)科;2.公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院流行病學(xué)系,廣東廣州510515)

大腸埃希菌是臨床分離最常見的病原菌之一。近年來由于抗生素的廣泛應(yīng)用及濫用,大腸埃希菌的耐藥情況越來越嚴(yán)重,多重耐藥的菌株越來越多[1,2],給臨床治療帶來了極大的困難。為此,本研究對臨床分離大腸埃希菌藥敏進(jìn)行分析,并對其耐藥機(jī)制進(jìn)行研究,如整合子、插入序列共同區(qū)(insertion sequences common regions,ISCR/orf513)和產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrumβ-lactamases,ESBLs)等,同時(shí)用腸桿菌科間的重復(fù)序列(Entrobacter repetive intergenic consensus,ERIC)-PCR對菌株基因多態(tài)性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 2008年7月-2009年6月從本院患者送檢標(biāo)本中分離出535株大腸埃希菌,經(jīng)BD pheonix 100全自動(dòng)微生物分析儀進(jìn)行鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)。從中選出99株進(jìn)行整合子、ISCR、ESBLs(TEM、SHV、CTX)研究及分析,陽性對照為預(yù)實(shí)驗(yàn)中 PCR陽性并經(jīng)測序驗(yàn)證的菌株,菌株號(hào)為NF813152(I類整合酶),NF511434(ISCR),NF601074(TEM),NF5274(SHV)和NF512990(CTX),陰性對照為大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25922。

1.1.2 試劑 dNTPs、TaqDNA聚合酶、蛋白酶 K和DNA Marker由大連瑞真生物技術(shù)有限公司提供;引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司提供;Tris飽和酚、氯仿、10%十二烷基硫酸鈉(SDS)等由廣州鼎國生物技術(shù)有限公司提供。

1.1.3 儀器 Eppendorf公司的DNA擴(kuò)增儀;Bio-Rad公司的凝膠成像儀。

1.2 方法

1.2.1 藥敏分析 用WHONET5.4分析535株大腸埃希菌的藥敏情況,用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

1.2.2 菌株基因組DNA的抽提 用SDS-蛋白酶 K-酚-氯仿方法進(jìn)行提取。

1.2.3 PCR檢測整合子、ISCR、ESBLs(TEM、SHV、CTX)基因 引物見表1,反應(yīng)體系總體積20μl,其中10×PCR緩沖液 2μl,MgCl21.25μl,dNTP 1.6μl,引物各0.5μl,DNA模板0.5μl,TaqDNA聚合酶1 U,滅菌雙蒸水14μl。I類整合酶的反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min;94℃變性30 s,50℃退火40 s,72℃延伸40 s,30個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。ISCR的反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,30個(gè)循環(huán);72℃延伸5min。ESBLs的反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中(含0.5μg/ml溴化乙錠),電壓5 V/cm,電泳20分鐘,凝膠成像儀觀察結(jié)果。

表1 研究整合子、ISCR、ESBLs所用引物

1.2.4 PCR陽性株的測序驗(yàn)證 對 PCR陽性的TEM、CTX各隨機(jī)抽取3株,及1株SHV進(jìn)行測序,在GenBank上比對分析。

1.2.5 用ERIC-PCR對99株大腸埃希菌的基因進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行同源性分析 引物序列為 ERIC-2(5’-aagtaagtgactggggtgagcg-3’)[6]。PCR 反應(yīng)體系如前所述,而反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,52℃退火45 s,72℃延伸4 min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中(含0.5 μg/ml溴化乙錠),電壓5 V/cm,電泳90 min,凝膠成像儀觀察結(jié)果,并用SPSS13.0進(jìn)行聚類分析。聚類分析所用主要參數(shù)為:Cluster:Variables;Plots:Dendrogram;Cluster Method:Between-groups linkage;Measure:Interval:Pearson correlation。

2 結(jié)果

2.1 535株大腸埃希菌的藥敏結(jié)果 535株大腸埃希菌中有305株產(chǎn)ESBLs,230株不產(chǎn) ESBLs,兩組耐藥情況比較見表2。

2.2 整合子、ISCR、ESBLs基因的檢測結(jié)果 99株大腸埃希菌中有72株產(chǎn) ESBLs,27株不產(chǎn) ESBLs。整合子、ISCR、ESBLs電泳結(jié)果見圖1-3,陽性結(jié)果分析見表3。

圖1 I類整合酶電泳結(jié)果

圖2 ISCR電泳結(jié)果blaTEM

表2 產(chǎn)與不產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌藥敏結(jié)果比較

圖3 ESBLs電泳結(jié)果

表3 I類整合酶、ISCR、ESBLs基因檢測結(jié)果

2.3 基因分型結(jié)果 ERIC-PCR對99株大腸埃希菌的基因分型結(jié)果見圖4。均能擴(kuò)增出清晰的DNA指紋圖譜。72株產(chǎn) ESBLs菌株擴(kuò)增出條帶2-14條,27株不產(chǎn) ESBLs菌株擴(kuò)增出條帶4-12條,兩者條帶均集中分布在300-3 000 bp。

2.4 系統(tǒng)聚類結(jié)果 99株大腸埃希菌的基因型分為79種,經(jīng)SPSS分析,歸為18個(gè)大類。按指紋圖的18類進(jìn)行比較,具體見表4。另外10株ISCR陽性株分別屬于 2、3、4、7、8、10、15、16 和 18 類。

3 討論

圖4 99株大腸埃希菌ERIC-PCR結(jié)果

表4 99株大腸埃希菌指紋圖系統(tǒng)聚類結(jié)果

近年來,大腸埃希菌多重耐藥情況越來越嚴(yán)重,其耐藥機(jī)制如整合子、ISCR、ESBLs等研究的比較多。整合子作為一種可移動(dòng)基因元件,不僅可通過位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)在細(xì)菌間播散,而且具有捕獲耐藥基因盒的功能,使細(xì)菌具有耐藥性,甚至是多重耐藥[7]。整合子的分類主要是根據(jù)整合酶的不同來分,因此,一般通過檢測整合酶來區(qū)分整合子類型。ISCR的名字是由“common regions”(CRs)和“insertion sequences”(ISs)得來的,目前為止,國內(nèi)尚無統(tǒng)一的定義[8]。ISCR是一類傳播耐藥基因元件,其中研究最多的是ISCR1,研究表明它與多種耐藥基因相關(guān),其還能解釋耐藥基因移動(dòng)的實(shí)質(zhì)和耐藥基因亞種的增長[8]。大腸埃希菌是主要的產(chǎn) ESBLs革蘭氏陰性桿菌[9]。國內(nèi),有報(bào)道 ESBLs以SHV和CTX-M為主要基因型,不同亞型的酶也呈區(qū)域性分布[10]。這種ESBLs基因型差異可能與不同國家、地區(qū)和醫(yī)院使用第三代頭孢菌素的種類、數(shù)量及時(shí)間不同而造成細(xì)菌對ESBLs的誘導(dǎo)產(chǎn)生不同有關(guān)。本研究中,產(chǎn)ESBLs株的I類整合酶陽性率明顯高于不產(chǎn) ESBLs株;同時(shí)含有I類整合酶和ISCR的有9株,提示整合子和 ISCR可能形成串聯(lián)關(guān)系,共同存在于細(xì)菌基因組中,可能共同介導(dǎo)細(xì)菌的多重耐藥,這還須進(jìn)一步的研究證明。分析535株大腸埃希菌是否產(chǎn)ESBLs兩組的藥物敏感性:除亞胺培南、美洛培南、四環(huán)素和哌拉西林/他唑巴坦,產(chǎn) ESBLs菌的耐藥率明顯高于不產(chǎn)ESBLs菌(P＜0.05)。兩者對碳青霉烯類藥物(亞胺培南和美洛培南)的耐藥率最低,說明碳青霉烯類抗生素是目前治療產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌最有效的藥物。另外,本研究產(chǎn)ESBLs菌TEM陽性率為80.6%,SHV為0%,CTX-M為36.1%;而不產(chǎn)ESBLs菌TEM陽性率為81.5%,SHV為3.7%,CTX-M為3.7%。從PCR結(jié)果可以看到本院產(chǎn)ESBLs菌以TEM和CTX-M為主。但目前為止,我國流行的ESBLs主要是以水解頭孢噻肟為主的CTX-M型ESBLs,TEM型ESBLs的報(bào)道很少。為了驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)的TEM陽性是TEM-1(廣譜β-內(nèi)酰胺酶,非 ESBLs類)還是其它 TEM型 ESBLs,隨機(jī)抽取三個(gè)標(biāo)本進(jìn)行測序,在GenBank上比對后發(fā)現(xiàn)均為TEM-1,表明我院產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌以CTX-M基因型為主。

現(xiàn)在細(xì)菌分型用的最多是分子生物學(xué)分型方法,如質(zhì)粒圖譜、限制性核酸內(nèi)切酶圖譜、脈沖場凝膠電泳(PFGE)、隨機(jī)引物 PCR(RAPD)、重復(fù)基因外回文序列-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(REP-PCR)及 ERIC-PCR等。其中,PFGE的分辨率最好,被譽(yù)為基因分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”,但由于PFGE需要特殊設(shè)備且價(jià)格很昂貴,在我國臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用PFGE進(jìn)行基因分型及流行病學(xué)調(diào)查較困難。ERIC-PCR分型技術(shù)是在REP-PCR的基礎(chǔ)上,以 ERIC為引物進(jìn)行 PCR的方法,能擴(kuò)增出多態(tài)性的DNA圖譜。這種PCR能產(chǎn)生多種獨(dú)特的擴(kuò)增產(chǎn)物,可根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶來區(qū)分細(xì)菌型別。本研究中,99株大腸埃希菌的分型率為100%,而且各條帶能很好的區(qū)分出來,分辨率較高。根據(jù)結(jié)果顯示,按是否產(chǎn) ESBLs來分成兩組,產(chǎn) ESBLs組特有3,5,6,15和16類;而不產(chǎn) ESBLs組特有1,13和14類,說明是否產(chǎn) ESBLs的大腸埃希菌的基因型存在一定的差異,產(chǎn)ESBLs株的基因多態(tài)性比不產(chǎn)酶株多。雖然ERIC-PCR分型的分辨率雖不及PFGE的高,但其操作簡單、經(jīng)濟(jì)、簡便、重復(fù)性較好,在具備進(jìn)行PCR條件的實(shí)驗(yàn)室就可以進(jìn)行基因分型,是較為理想的流行病學(xué)調(diào)查方法[11]。從本研究的ERIC-PCR結(jié)果來看,99株大腸埃希菌的基因型分為79種,我院大腸埃希菌主要是散發(fā)存在。ERIC-PCR的分型率高、分辨率強(qiáng)及重復(fù)性好,是一種效果較好的基因分型方法,適合用于臨床實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行大量標(biāo)本的基因分型。

[1]魏 東,周洪波,芮勇宇,等.我院近3年臨床分離細(xì)菌的耐藥性變遷分析[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2008,12(6):733.

[2]芮勇宇,耿穗娜,王 前,等.5504株臨床分離細(xì)菌和念珠菌的分布及耐藥性分析[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2007,11(12):1651.

[3]顧 兵,童明慶,劉根焰,等.整合子介導(dǎo)大腸埃希菌和克雷伯菌多重耐藥機(jī)制的研究[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2006,29(8):725.

[4]QuirogaM P,Andres P,Petroni A,etal.Complex class1 integronswith diverse variable regions,including aac(6’)-Ib-cr,and a novel allele,qnrB10,associated with ISCR1 in clinical enterobacterial isolates from Argentina[J].Antimicrob Agents Chemother,2007,51(12):4466.

[5]Kiratisin P,Apisarnthanarak A,Laesripa C,etal.Molecular characterization and epidemiology of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolates causing health care-associated infection in Thailand,where the CTX-M family is endemic[J].Antimicrob Agents Chemother,2008,52(8):2818.

[6]Munoz M A,Welcome FL,Schukken YH,etal.Molecular epidemiologyof two Klebsiella pneumoniaemastitisoutbreakson a dairy farm in New York State[J].JClin Microbiol,2007,45(12):3964.

[7]Mazel D.Integrons:agentsof bacterial evolution[J].Nat Rev Microbiol,2006,4(8):608.

[8]Toleman M A,Bennett PM,Walsh T R.ISCR elements:novel gene-capturing systems of the 21st century[J].Microbiol Mol Biol Rev,2006,70(2):296.

[9]姜 森,張 正,楊 朵,等.2062株大腸桿菌 ESBL測定及耐藥分析[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2008,12(9):1134.

[10]Oksuz L,Gurler N.Typing of extended-spectrum beta-lactamases in Escherichia coli and Klebsiella spp.strains and analysisof plasmid profiles[J].Mikrobiyol Bul,2009,43(2):183.

[11]Wardak S,JagielskiM.Evaluationof genotypic and phenotypicmethods for the differentiation of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli clinical isolates from Poland.II.PFGE,ERIC-PCR,PCR-flaA-RFLP and MLST[J].Med Dosw Mikrobiol,2009,61(1):63.