嵇 豪 蔣冬花 周 琴 汪鵬榮 董夏夢(mèng) 蔡琪敏

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，金華 321004)

D001陽離子交換樹脂分離紅曲霉發(fā)酵液中γ－氨基丁酸的研究

嵇 豪 蔣冬花 周 琴 汪鵬榮 董夏夢(mèng) 蔡琪敏

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，金華 321004)

研究了紅曲霉發(fā)酵液中的γ－氨基丁酸(GABA)分離純化工藝。對(duì)3種脫色劑進(jìn)行篩選，D101樹脂對(duì)紅曲發(fā)酵液具有最高的脫色率和GABA得率。分別以靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附－解析方法考察D001離子交換樹脂對(duì)GABA的最優(yōu)分離條件，結(jié)果表明:脫色發(fā)酵液pH下上樣，上樣流速為1 BV/h，采用水和2 mol/L氨水兩步洗脫，洗脫液濃縮后結(jié)晶為透明針狀，GABA的總得率為45．4%。

γ－氨基丁酸 紅曲霉發(fā)酵液 D001陽離子樹脂 分離

γ－氨基丁酸(GABA)是一種廣泛存在于動(dòng)植物中的一種非蛋白質(zhì)氨基酸，由谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶催化轉(zhuǎn)化而來，是存在于哺乳動(dòng)物脊髓、大腦中的重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有突觸后抑制作用，可通過突觸后膜超極化、減少離子內(nèi)流，降低細(xì)胞代謝及氧消耗等機(jī)制，是突觸后神經(jīng)元處于保護(hù)性抑制狀態(tài)，并可通過突出前抑制減少谷氨酸的釋放，從而減少灌注區(qū)神經(jīng)元的死亡［1－2］。報(bào)道的GABA生理功能基本與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)，主要包括降血壓功能，促生長(zhǎng)功能，促進(jìn)生殖，治療癲癇，抗衰老等［3］。

目前GABA的制備方法主要有化學(xué)合成法和生物合成法［4］。其中生物合成法生產(chǎn)主要是利用微生物技術(shù)，通過篩選優(yōu)良高產(chǎn)的安全菌種，發(fā)酵生產(chǎn)GABA制劑，可以認(rèn)為是天然食品添加劑，我國衛(wèi)生部于2009年將食品級(jí)GABA確定為新資源食品用于食品生產(chǎn)加工。食品級(jí)GABA主要以谷氨酸鈉為原料經(jīng)乳酸菌發(fā)酵，再分離純化得制品。紅曲是我國傳統(tǒng)具有藥食兩用的發(fā)酵產(chǎn)品，現(xiàn)代研究證明紅曲所具有的降壓作用主要是由紅曲霉的次級(jí)代謝產(chǎn)物GABA所引起的。紅曲霉的高度安全性為GABA的生產(chǎn)提供了另一條可靠的途徑［5］。本文試圖通過使用陽離子交換樹脂對(duì)紅曲霉發(fā)酵液中的GABA進(jìn)行分離純化，為食品級(jí)GABA的商業(yè)生產(chǎn)提供一定的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1．1 材料

活性炭:浙江省金華市醫(yī)藥公司;D001陽離子交換樹脂，D101，D301大孔吸附樹脂:西安藍(lán)曉科技有限公司;GABA標(biāo)準(zhǔn)品:SIGAMA公司;高產(chǎn)GABA紅曲霉發(fā)酵液(6 g/L)［6］:浙江師范大學(xué)微生物研究室。

1．2 主要儀器設(shè)備

RE－52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:上海亞榮生化儀器廠;SHZ－D循環(huán)水式多用真空泵:河南省予華儀器廠;BT600－2J蠕動(dòng)泵:保定蘭格恒流泵有限公司;100GPDRO反滲透純水儀:上海和泰儀器有限公司;3．0 cm×50 cm玻璃層析柱:海門市盛邦實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1．3 試驗(yàn)方法

1．3．1 紅曲霉發(fā)酵液預(yù)處理

取紅曲霉發(fā)酵液沸水浴10 min后12 000 r/min離心15 min［7］，取上清液4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3．2 GABA含量和色價(jià)的測(cè)定

采用改良紙層析法測(cè)定 GABA含量［8］。按0．004 g/mL加入顯色劑茚三酮到展開劑中，取5 μL發(fā)酵上清液點(diǎn)樣，GABA標(biāo)準(zhǔn)品做參比。采用新華一號(hào)層析紙展開后于90℃下顯色10 min。將待測(cè)樣和標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)剪下，用0．1%硫酸銅∶75%乙醇=2∶38的洗脫液洗脫，于520 nm處比色測(cè)定。平行3次，取平均值。另配置不同濃度的GABA標(biāo)準(zhǔn)液，按上述方法洗脫比色，以GABA濃度對(duì)A520繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，GABA濃度可根據(jù)吸光度大小由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得。

GABA損失率=(脫色前GABA含量－脫色后GABA含量)/脫色前GABA含量×100%

脫色率=(脫色前色價(jià)－脫色后色價(jià))/脫色前色價(jià)×100%

取發(fā)酵液上清液，用去離子水適當(dāng)稀釋后以去離子水為參比在505 nm下測(cè)吸光度。

發(fā)酵液色價(jià)=OD505×稀釋倍數(shù)

1．3．3 樹脂的預(yù)處理

以去離子水浸泡樹脂洗去大量泡沫，乙醇浸泡后漂至上清液澄清，再用去離子水洗至無醇味。2 mol/L NaOH浸泡6 h后水洗至中性，再用2 mol/L HCl浸泡6 h水洗至中性，最后將樹脂浸泡于去離子水中備用［9］。

1．3．4 靜態(tài)吸附試驗(yàn)

將一定初始濃度的GABA加入250 mL的錐形瓶中，再各加入一定量的樹脂，用NaOH或HCl調(diào)節(jié)發(fā)酵上清液pH值，恒溫振蕩至平衡。吸附平衡后，液相濃度由改良紙層析法確定，吸附相濃度由下式計(jì)算［9］:

式中:q為平衡吸附量/mg/每克濕樹脂;V為溶液體積/L;c0為GABA初始質(zhì)量濃度/g/L;ce為GABA平衡時(shí)的質(zhì)量濃度/g/L;W為離子交換樹脂質(zhì)量/g。

1．3．5 動(dòng)態(tài)吸附與洗脫

將已經(jīng)過預(yù)處理的發(fā)酵液，調(diào)至一定的pH值，用蠕動(dòng)泵控制一定的流速上樣，同時(shí)用分部收集器對(duì)流出液分部收集，測(cè)定其中的GABA含量。以流出液體積為橫坐標(biāo)，ce/c0為縱坐標(biāo)，繪制穿透曲線。

配制一定濃度的洗脫劑，蠕動(dòng)泵恒速上柱，分部收集器收集流出液，測(cè)定流出液GABA含量。以洗脫液體積為橫坐標(biāo)，GABA濃度為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。

2 結(jié)果與分析

2．1 紅曲發(fā)酵液的脫色

紅曲色素是紅曲霉的主要次級(jí)代謝產(chǎn)物之一，工業(yè)上利用紅曲霉液體深層發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素，常作為食品添加劑應(yīng)用于食品工業(yè)［10］。本試驗(yàn)所采用的高產(chǎn)GABA紅曲霉X27產(chǎn)紅曲色素能力良好，發(fā)酵液色價(jià)達(dá)到22．4 U/mL，因此從發(fā)酵液中分離純化GABA的首要任務(wù)是將色素脫除。分別以大孔樹脂D101、D301和活性炭顆粒作為脫色劑，從脫色結(jié)果上看，以D101大孔樹脂作為脫色劑，在添加量30%以上時(shí)脫色效果顯著，脫色率達(dá)到90%以上?；钚蕴孔鳛槌Ｓ玫拿撋珓?，脫色效果較為顯著，但由于其不易再生、成本高，且脫色要求溫度高，GABA損失率大。綜合上述優(yōu)缺點(diǎn)，選用30%的D101對(duì)發(fā)酵上清液進(jìn)行脫色處理。

圖1 脫色劑對(duì)脫色率及GABA損失率的影響

2．2 pH對(duì)D001交換容量的影響

pH是影響離子交換平衡關(guān)系的重要因素。GABA是兩性電解質(zhì)，其凈電荷取決于自身等電點(diǎn)及溶液的pH值。理論上選擇一個(gè)酸性環(huán)境，GABA主要呈陽離子狀態(tài)，有利于同陽離子樹脂的交換［11］。在靜態(tài)吸附試驗(yàn)中，酸性條件下，樹脂保持一個(gè)較大的交換容量，pH在5～7之間，樹脂的交換容量達(dá)到最大值，之后隨著pH的升高交換容量快速下降。由于樹脂中的H+與GABA發(fā)生交換，導(dǎo)致交換體系的pH值下降;而經(jīng)過脫色的發(fā)酵液主要成分為GABA(pI=7．5)及其前體物質(zhì)谷氨酸(pI=3．22)，當(dāng)體系的pH下降，谷氨酸質(zhì)子化易與GABA發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附，導(dǎo)致交換容量降低。因此對(duì)GABA和谷氨酸的分離需要在動(dòng)態(tài)吸附過程中進(jìn)一步考察。紅曲霉為嗜酸腐生真菌，因此其發(fā)酵液一般保持在酸性環(huán)境，經(jīng)脫色處理的發(fā)酵上清液pH為5．86，可以直接用來上柱。

表1 pH對(duì)D001樹脂交換容量的影響

2．3 D001樹脂對(duì)GABA的吸附等溫線及吸附動(dòng)力學(xué)曲線

吸附等溫線是指在一定溫度下溶質(zhì)分子在兩相界面上進(jìn)行的吸附過程達(dá)到平衡時(shí)它們?cè)趦上嘀袧舛戎g的關(guān)系曲線。在室溫條件下，D001陽離子交換樹脂的吸附等溫線如圖2所示。隨著GABA的濃度升高，D001樹脂的交換容量增大，當(dāng)質(zhì)量濃度大于5 g/L后，繼續(xù)增加GABA濃度對(duì)樹脂的交換容量影響不大。

相對(duì)于凝膠型樹脂，大孔樹脂具有表面積大，交換速度快等特點(diǎn)，因此大孔樹脂的利用率更高。在靜態(tài)試驗(yàn)中，分別測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)的樹脂交換容量，圖2顯示D001樹脂很快對(duì)GABA進(jìn)行吸附作用，并在60 min時(shí)離子交換量達(dá)到最大值，交換容量達(dá)160 mg/g。因此選擇大孔型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂D001作為GABA的分離介質(zhì)是合適的。

圖2 D001樹脂對(duì)GABA的吸附等溫線及吸附動(dòng)力學(xué)曲線

2．4 上樣流速對(duì)吸附的影響

上樣液選擇的流速是離子交換過程中的一個(gè)重要參數(shù)，為了使物質(zhì)發(fā)生有效的交換，必須使固液兩相有充分的接觸時(shí)間。流速過快容易造成交換區(qū)拉長(zhǎng)，提前發(fā)生滲漏。流速過慢則降低交換效率。如圖3所示，分別以0．5、1、2 BV/h的流速上樣。當(dāng)流速為2 BV/h時(shí)，穿透點(diǎn)出現(xiàn)較早，樹脂提前發(fā)生滲漏，造成GABA流失。流速下降則穿透點(diǎn)延遲，樹脂利用率高。流速降為0．5 BV/h穿透點(diǎn)變化不大，且鑒于低流速導(dǎo)致上柱時(shí)間延長(zhǎng)，適宜的上樣流速選擇為1 BV/h。

2．5 洗脫液濃度對(duì)解吸的影響

氨基酸離子交換的常用洗脫劑有氨水、銨鹽溶液和NaOH溶液等，由于氨水具有揮發(fā)性容易除去且不易帶入雜質(zhì)，所以選擇氨水作為洗脫劑。上樣過程中，部分前體物質(zhì)谷氨酸通過競(jìng)爭(zhēng)作用被樹脂吸附，直接用氨水洗脫無法保證兩種物質(zhì)的分離效果。由于谷氨酸是酸性氨基酸，因此可以在氨水洗脫前以大量去離子水對(duì)樹脂進(jìn)行水洗處理，處于解離狀態(tài)的谷氨酸易被去離子水洗去。

分別以1、2 mol/L的氨水作為洗脫劑，1 BV/h的流速對(duì)飽和樹脂柱進(jìn)行洗脫，測(cè)定各取樣點(diǎn)的GABA含量。以1 mol/L氨水為洗脫劑時(shí)，GABA峰形較寬，峰值不集中，洗脫劑使用量大;而使用濃度更高的氨水，由于離子強(qiáng)度大置換速度快，峰值較為集中，洗脫周期短，因此應(yīng)選擇2 mol/L的氨水作為洗脫劑。

2．6 洗脫液收集、濃縮與結(jié)晶

一般的結(jié)晶方法有冷卻結(jié)晶、蒸發(fā)結(jié)晶及反應(yīng)結(jié)晶3種工藝［12］。另外，氨基酸結(jié)晶工業(yè)中常向氨基酸水溶液中加入適量有機(jī)溶劑來降低其飽和濃度達(dá)到結(jié)晶的目的［13］。收集洗脫液后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于60℃下真空濃縮得GABA固形物，少量去離子水復(fù)溶后立即加入8倍體積無水乙醇，將溫度降至室溫后再于4℃冰箱靜置12 h后，過濾收集晶體。如圖5所示GABA結(jié)明晶為透針狀，GABA的總收率為45．4%。

圖5 GABA的針狀結(jié)晶

3 結(jié)論

通過離子交換法分離純化紅曲霉發(fā)酵液中GABA，比較3種脫色劑的脫色效果及GABA損失率選擇D101大孔樹脂作為紅曲發(fā)酵液的脫色劑。30%的D101添加量脫色率達(dá)到90%以上，且GABA損失率僅5%左右。

在靜態(tài)試驗(yàn)下，考察了上樣液的最佳上樣pH及D001對(duì)GABA的等溫吸附線及吸附動(dòng)力學(xué)。結(jié)果顯示D001樹脂與GABA交換速度快，效率高，經(jīng)過脫色的發(fā)酵液pH適宜直接上柱。

在動(dòng)態(tài)條件下，選擇1 BV/h的上樣流速，氨水洗脫前用去離子水水洗除去谷氨酸，洗脫液氨水的濃度為2 mol/L，收集發(fā)酵液濃縮后結(jié)晶可得透明針狀結(jié)晶，GABA的總得率為45．4%。

［1］Nicolas B，Bouche B，Hillel F．GABA signaling:a conserved and ubiquitous mechanism［J］．Trends in Cell Biology，2003，13(2):607－611

［2］Bassry S，Alan B，Michel M．Metabolism and function of gamma － amino butyric acid［J］．Trend in Plant Science，1999，4(11):446－453

［3］許建軍，江波，許時(shí)嬰．γ－氨基丁酸(GABA)——種新型的功能食品因子［J］．食品工業(yè)科技，2003，24(1):109－110

［4］白松，林向陽，阮榕生，等．γ－氨基丁酸的分布和制備［J］．現(xiàn)代食品科技，2005，21(2):202 －205

［5］Kono I，Himeno K．Changes in γ － aminobutyric acid content during beni－ koji making［J］．Biosci Biotechnol Biochem，2000，64:617 －619

［6］Jiang DH，Ji H，Ye Y，et al．Studies on screening of higher c－aminobutyric acid－producing Monascus and optimization of fermentative parameters［J］．European Food Research and Technology，2011，232(3):541 － 547

［7］蔣冬花，后加衡，李杰，等．紅腐乳中高產(chǎn)γ－氨基丁酸紅曲霉菌株的篩選［J］．浙江師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2007，30(4):447 －452

［8］夏江，梅樂和，黃俊，等．產(chǎn)γ－氨基丁酸的乳酸菌株篩選及誘變［J］．核農(nóng)學(xué)報(bào)，2006，2(5):379 －382

［9］付勇，吳國光，彭奇均．D001型陽離子交換樹脂吸附L－蘇氨酸［J］．化工進(jìn)展，2007，26(3):422 －425

［10］趙燕，溫輝梁，胡曉波．紅曲色素及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用［J］．中國食品添加劑，2004，(4):90 －93

［11］劉崇鳳，付彩霞．氨基酸等電點(diǎn)與 pKa的關(guān)系［J］．曲阜師范大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，22(1):97 －99

［12］馮容保．氨基酸的結(jié)晶工藝［J］．發(fā)酵科技通訊，2002，31(4):11－12

［13］馬強(qiáng)，張濤，江波，等．γ－氨基丁酸結(jié)晶熱力學(xué)的研究［J］．食品工業(yè)科技，2010，31(2):77 －79．

Study on Separation of γ－Aminobutyric Acid from Monascus Fermentation Broth by D001 Ion－exchange Resins

Ji Hao Jiang Donghua Zhou Qin Wang Pengrong Dong Xiameng Cai Qimin

(College of Chemistry and Life Sciences，Zhejiang Normal University，Jinhua 321004)

The separation process of γ－Aminobutyric acid(GABA)from monascus fermentation broth was researched．Three types of decolorants were selected，and the D101 exhibited high decoloring ratio and high GABA yield．The static and dynamic adsorption－desorption performances were investigated to obtain optimized conditions of GABA separation by D001 ion － exchange resins．The result showed that the optimum parameters were as follows:original pH of decolor fermentation broth，sample flow － rate of 1 BV/h，elution method of two steps by using water and 2 mol/L aqueous ammonia．The transparence needle crystal of GABA was obtained after the effluent concentrated．The total recovery rate was 45．4%．

γ －Aminobutyric acid，monascus fermentation broth，D001 ion－exchange resins，separation

Q819

A

1003－0174(2011)08－0095－05

國家自然科學(xué)基金(31070008)，浙江省自然科學(xué)基金(Y3090343)

2010－11－02

嵇豪，男，1986年出生，碩士，應(yīng)用微生物學(xué)

蔣冬花，女，1964年出生，教授，微生物學(xué)和植物病理學(xué)