楊 虹 姜元榮 魏婷婷 王 偉

(豐益 (上海)生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司,上海 200137)

食用油中植物甾醇測(cè)定方法的優(yōu)化及含量分析

楊 虹 姜元榮 魏婷婷 王 偉

(豐益 (上海)生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司,上海 200137)

研究了食用油中植物甾醇的檢測(cè)方法,并將液相色譜法與薄層色譜法、實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化的方法進(jìn)行了比較,結(jié)果表明,優(yōu)化后的方法具有分析速度快、準(zhǔn)確性高和精密度好的優(yōu)點(diǎn)。同時(shí),利用此檢測(cè)方法,對(duì)油脂加工過(guò)程中植物甾醇的含量進(jìn)行了追蹤分析,考察了油脂在精煉過(guò)程中的甾醇損失情況。另外,還對(duì)不同種類植物油的毛油和脫臭餾出物中植物甾醇的組成及含量進(jìn)行了分析,為將來(lái)相關(guān)領(lǐng)域開(kāi)發(fā)應(yīng)用方面的研究提供了參考數(shù)據(jù)。

植物甾醇 毛細(xì)管氣相色譜法 液相色譜法 薄層液相色譜法 毛油 脫臭餾出物

甾醇 (Sterol)又名固醇,是一類極其復(fù)雜的化合物。甾醇在動(dòng)物和植物體內(nèi)均存在,動(dòng)物體內(nèi)以膽固醇為主,習(xí)慣上將其稱為動(dòng)物甾醇;而植物油脂中主要是植物甾醇在植物細(xì)胞中起著穩(wěn)定細(xì)胞膜的作用?，F(xiàn)已確認(rèn)了 40多種植物甾醇,其中以β-谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇為主[1-2],其結(jié)構(gòu)式如圖 1所示。這些甾醇的結(jié)構(gòu)與膽固醇結(jié)構(gòu)基本相似,都屬于 4-無(wú)甲基甾醇,具有相同的手性結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)上唯一不同之處是環(huán)戊烷全氫菲骨架帶有側(cè)鏈,正是這些側(cè)鏈上的微小差異導(dǎo)致了它們的生理功能的極大不同。臨床試驗(yàn)表明,植物甾醇具有降低膽固醇的顯著作用,可以用于防治心血管疾病。最近,美國(guó)食品與藥物管理局(FDA)正式批準(zhǔn)植物甾醇可用于各類含脂肪食品中[3-4]。

目前對(duì)于甾醇定量測(cè)定方法主要有液相色譜 -紫外檢測(cè)法測(cè)定法 (HPLC-UV)、薄層色譜法 (TLC)和氣相色譜法 (GC)。其中液相色譜 -紫外檢測(cè)法缺點(diǎn)在于不能將甾醇完全分離,且靈敏度低,而薄層色譜法操作繁瑣費(fèi)時(shí)費(fèi)溶劑,不便于進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控生產(chǎn)。本研究利用在實(shí)驗(yàn)室建立的氣相色譜法分析了 3種主要甾醇組分的含量,并與液相色譜法和薄層色譜法相比,具有分辨率高,定量準(zhǔn)確,操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),并使其在工廠生產(chǎn)中對(duì)甾醇來(lái)源的分析,質(zhì)量指標(biāo)的檢驗(yàn)更為快速有效。

圖 1 主要甾醇的結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

β-谷甾醇 (β -sitosterol,純度 75%)、豆甾醇(Stigmasterol,純度 95%)、菜油甾醇 (Brassicasterol,純度 65%)、β-膽甾烷醇 (Cholesterol,純度 96%):比利時(shí) Acros公司;正己烷為色譜級(jí)。

2.0 mol/mL氫氧化鉀 -乙醇溶液的配制:將 5.6 g氫氧化鉀溶解在 5 mL水中.冷至室溫后,用乙醇稀釋至45 mL。

BSTFA+T MCS雙 (三甲基硅烷基)三氟乙酰胺 ∶三甲基氯硅烷 =99∶1

Agilent6890 GC-FI D、Agilent1100 HPLC-UV:美國(guó)安捷倫公司.

1.2 分析方法

1.2.1 液相色譜法

1.2.1.1 樣品分析步驟

稱量樣品油 (1.0±0.2)g,加入 5 mL KOH-95%乙醇溶液皂化 30 min,皂化液冷卻至室溫后,加飽和氯化鈉水溶液 25 mL移至分液漏斗中,分 3次每次用石油醚 30 mL提取,把石油醚提取液合并。用蒸餾水 25 mL多次洗石油醚層至中性,石油醚層用無(wú)水硫酸鈉脫水后濾過(guò),在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中通氮?dú)鉂饪s至近干,得到的殘?jiān)脽o(wú)水乙醇定容,混勻,過(guò)

0.45 μm微孔濾膜后,進(jìn)行 HPLC測(cè)定。

1.2.1.2 液相色譜條件

色譜柱:Agilent C18 Column(250 mm×4.6 mm×5μm);流動(dòng)相:甲醇 ∶水 (98.5∶1.5,體積比 );檢測(cè)波長(zhǎng) 210 nm;柱溫 50℃;流速 1.0 mL/min,進(jìn)樣量20μL。

1.2.2 薄層色譜法

1.2.2.1 樣品分析步驟

稱取約 (2.0±0.2)g試樣,加入 0.01 gβ-膽甾烷醇標(biāo)準(zhǔn)品作內(nèi)標(biāo),按 ISO 3596-1或 ISO 3596-2回流方式制備非皂化物,濃縮后,用薄層色譜分離甾醇。

用氣相色譜測(cè)定甾醇含量。

1.2.2.2 氣相色譜條件

色譜柱:SE-54 50.0 m ×250μm(id)×0.1 mm(膜厚 )毛細(xì)管柱;載氣 :H2;流速:36 cm/s;柱溫 :從240℃起以 4℃/min的升溫速率升至 255℃;進(jìn)樣口溫度:300℃;檢測(cè)器溫度:320℃;分流比:20∶1;進(jìn)樣量:1μL。

1.2.3 試驗(yàn)室新方法的前處理方法

1.2.3.1 樣品分析步驟

(1)稱取 200 mg油樣及內(nèi)標(biāo) 2 mgβ-膽甾烷醇(植物油中不含膽甾烷醇,但它與植物油甾醇結(jié)構(gòu)相似,保留時(shí)間接近,且能完全分離,適合做分析植物甾醇含量的內(nèi)標(biāo)物質(zhì))標(biāo)準(zhǔn)品于離心管中,將離心管在室溫下水浴超聲處理。

(2)加入氫氧化鉀乙醇溶液后加蓋密封,在室溫下超聲水浴中處理 5 min,接著放入 60℃烘箱處理60 min。取出后,放在振動(dòng)混合器中震搖 2 min。

(3)冷卻后加入正己烷和水。振動(dòng)混合器萃取,然后在離心機(jī)中以 4 300 r/min離心 3 min。將上層有機(jī)液層用玻璃滴管轉(zhuǎn)移到另一只離心管中。繼續(xù)向離心管中加入正己烷。在振動(dòng)混合器萃取,然后在離心機(jī)中離心。將上層有機(jī)液層用玻璃滴管轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的離心管。

(4)將濃縮溶液轉(zhuǎn)移到樣品瓶中,在 85℃烘箱中蒸發(fā)溶液。

(5)加入 100μL BSTFA+T MCS,用加熱塊加熱105℃促進(jìn)反應(yīng) 15 min。

(6)轉(zhuǎn)移到自動(dòng)進(jìn)樣器安瓿瓶,并進(jìn)樣 1μL。

1.2.3.2 氣相色譜條件

色譜柱:HP-5 30.0 m ×320μm(id)×0.25 mm(膜厚)毛細(xì)管柱;載氣:He;流速:1.0 mL/min;柱溫:從 200℃起以 2℃/min的升溫速率升至 300℃;進(jìn)樣口溫度:300℃;檢測(cè)器溫度:360℃;分流比:50∶1;進(jìn)樣量:1μL。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

1.2.4.1 甾醇峰的定性

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品如β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、β-膽甾烷醇等的保留時(shí)間進(jìn)行定性。(如圖 2和4);

1.2.4.2 甾醇峰的定量

(1)液相色譜法定量 -外標(biāo)法

采用峰面積外標(biāo)法,根據(jù)被測(cè)組分和標(biāo)準(zhǔn)組分峰面積比可以算出被測(cè)組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù),進(jìn)行定量分析。

(2)氣相色譜法定量 -內(nèi)標(biāo)法

①樣品中單個(gè)甾醇的含量

單個(gè)甾醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Ws=(pm×Vis×As×pis)/(Ais×ms×1 000)

式中:pm為內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度/g/L;Vis為內(nèi)標(biāo)體積 /μL;As為單干甾醇的峰面積;Ais為內(nèi)標(biāo)峰面積;ms為樣品質(zhì)量 /mg;pis為內(nèi)標(biāo)的純度。

②樣品總甾醇的含量

總甾醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù) Ws=(pm×Vis×∑As×Pis)/(Ais×ms×1 000)

式中:∑As為各個(gè)甾醇的峰面積之和。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜檢測(cè)方法

對(duì)利用 HPLC檢測(cè)植物甾醇含量已有相關(guān)報(bào)道[5-7],由于此方法對(duì)于檢測(cè)甾醇不用衍生化即可直接進(jìn)樣分析,操作簡(jiǎn)便,可采用其制備色譜分離收集到甾醇各組分的標(biāo)準(zhǔn)品,所以首先考察了此方法定量的可行性。

圖 2 米糠油的 HPLC色譜圖

如圖 2所示,此方法存在分離效果不佳、靈敏度不高的缺點(diǎn),將會(huì)直接影響到最終的定量結(jié)果,所以,此方法不適合對(duì)食用油中植物甾醇進(jìn)行定量分析。

2.2 薄層色譜法

2.2.1 GC前處理方法的選擇

食用油中所含植物甾醇屬于微量,分析時(shí),采用先將油脂皂化處理后,再分析不皂化部分的處理手段是比較好的,因?yàn)檫@樣易于測(cè)定油中的微量組分。而 GC法對(duì)那些微量組分有較高的靈敏度。在通常的氣相色譜條件下,將未衍生的標(biāo)準(zhǔn)品直接進(jìn) GC可以得到各甾醇的峰,但各主要甾醇分離效果不理想,且拖尾較嚴(yán)重 (如圖 3所示),影響到定量結(jié)果。而將標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)BSTFA+T MCS試劑處理后,各甾醇的活性氫原子被硅烷基所取代,使甾醇的熱穩(wěn)定性更高,更易揮發(fā),同時(shí)其極性下降,檢測(cè)靈敏度提高 (如圖 4所示)。

由于此方法利用薄板分離,耗時(shí)耗力,不適宜在工廠進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控,于是實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化了樣品的前處理方法,以提高分析方法的精密性和實(shí)驗(yàn)的可操作性。

2.3 實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化方法的方法學(xué)考證

2.3.1 重復(fù)性

從表 1可知,TLC色譜方法的重復(fù)性的 RSD比優(yōu)化的氣相色譜法差。

表 1 TLC色譜法A與優(yōu)化方法B的重復(fù)性試驗(yàn)比較表

2.3.2 與 TLC色譜法比較結(jié)果

從表 2可知,優(yōu)化的氣相色譜法檢測(cè)結(jié)果與 TLC色譜法結(jié)果接近。

表 2 TLC色譜法A與優(yōu)化方法B的結(jié)果比較表

2.3.3 回收率的測(cè)定。

平行測(cè)定添加了 0%、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%植物甾醇酯的精煉玉米油的樣品。薄層色譜法回收率在 80%以上,但是 RSD值均達(dá)不到定量要求,大于 10%,而經(jīng)過(guò)優(yōu)化前處理方法,回收率在90%以上,其 RSD值低于 6%,說(shuō)明優(yōu)化后的方法精密度高,重復(fù)性好,結(jié)果可靠。

圖 5 TLC色譜法A與優(yōu)化方法B回收率比較

3 應(yīng)用

3.1 對(duì)同一批次,不同工藝下的食用菜籽油和大豆油中植物甾醇的組成及含量分析

由圖 6可知,4種加工工藝下,甾醇損失都是存在的。具體損失量與工廠的生產(chǎn)工藝密切相關(guān)。

圖 6 菜籽油和大豆油在 4種不同工藝下植物甾醇含量損失分析

3.2 對(duì)不同品種,食用植物油的毛油和脫臭餾出物中植物甾醇的組成及含量分析

近年來(lái),隨著生命科學(xué)、油脂科學(xué)與工程技術(shù)的迅猛發(fā)展,植物甾醇在醫(yī)藥、食品、化工、飼料和植物基因工程等領(lǐng)域被高度重視與關(guān)注。植物甾醇主要存在于油脂中,目前研究發(fā)現(xiàn),精煉油后的脫臭餾出物中富含植物甾醇,所以在大多數(shù)研究中,一般都以脫臭餾出物作為提取原料,脫臭餾出物中一般含有10%～30%不皂化物,其中約 40%是植物甾醇,15%是生育酚[8-9]。其研究結(jié)果可以為從脫臭餾出物中直接提取植物甾醇等相關(guān)研究提供參考。

表3

圖 7 各種常見(jiàn)植物毛油中植物甾醇平均含量圖

由表 3及圖 7可知,食用植物油均含有菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇,其中在含量上,以β-谷甾醇為主,其次是菜油甾醇和豆甾醇。同一類別而產(chǎn)地不同的植物毛油和脫臭餾出物中植物甾醇的比例基本一致,毛油總含量差異不大,而 FAD存在較大差異,可能與精煉方法、儲(chǔ)存條件、原料的品種以及生長(zhǎng)季節(jié)等多種因素有關(guān)。大豆油和葵花籽油的植物甾醇含量低于菜籽油和玉米油,所以由此推測(cè)我國(guó)南方居民從植物油中攝入的植物甾醇的量高于北方居民。因此建議居民可以通過(guò)食用植物甾醇含量高的植物油如玉米胚芽油、菜籽油等來(lái)增加植物甾醇的攝入量,以達(dá)到降低慢性病發(fā)生率的作用。

4 結(jié)論

4.1 研究表明,利用液相色譜法測(cè)定植物油中的甾醇含量,雖然不用衍生化即可直接進(jìn)樣分析,操作簡(jiǎn)便,但是分離效果欠佳,不適合選擇作為定量分析手段。將 TLC與優(yōu)化后的檢測(cè)方法進(jìn)行比較,雖然結(jié)果相近,但是 TLC操作繁瑣,不適宜在工廠進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控,并且重復(fù)性差,RSD遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于 5%,加樣回收率也不理想,低于 90%。而將植物油經(jīng)皂化處理,有機(jī)溶劑萃取,并硅烷化試劑衍生后,再利用氣相色譜測(cè)定甾醇含量,檢測(cè)結(jié)果能達(dá)到良好的準(zhǔn)確度和精密度,重復(fù)性 RSD和加樣回收率均能滿足定量要求。

4.2 運(yùn)用優(yōu)化后的檢測(cè)方法,探討了菜籽油和大豆油在 4種不同工藝下的植物甾醇的損失情況。實(shí)驗(yàn)表明植物油從原油 -中和油 -脫色油 -精煉油,甾醇保留量依次降低。因此應(yīng)降低精煉程度,減少甾醇損失量,且不斷加強(qiáng)對(duì)精煉過(guò)程中甾醇工藝的研究。

4.3 對(duì)不同種類的植物毛油和脫臭餾出物中甾醇含量進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,同一類別而產(chǎn)地不同的植物毛油中植物甾醇的總含量基本一致,脫臭餾出物種甾醇總含量存在一定的差異,可能與精煉方法、儲(chǔ)存條件、原料的品種以及生長(zhǎng)季節(jié)等多種因素有關(guān)。

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Opti mizingAnalysisMethod forDeter mination of Phytosterols in Edible Oils

Yang Hong Jiang Yuanrong Wei Tingting WangWei
(W i lmarBiotechnology Research&Development Center(Shanghai)Co.,Ltd,Shanghai 200137)

A method for deter mination of phytosterols in edible oilswas optimized and evaluated.After compa2 ring the method with high perfor mance liquid chromatography and thin layer chromatography,the method we devel2 oped was found to be more sensitive,rapid and accurate with good reproducibility.Using thismethod the phytosterol contents in different refining processeswere traced,and the loss of phytosterols in refining was accurately measured.Further more,the content and constitution of phytosterols in many kinds of crude vegetable oils and in deodorization distillateswere deter mined with thismethod.

phytosterol,gas chromatography,high performance liquid chromatography,crude oil,deodorization distillate

O657.7+1

A

1003-0174(2011)02-0120-05

2010-01-21

楊虹,女,1982年出生,碩士,分析化學(xué)

姜元榮,女,1970年出生,講師,博士,油脂與植物蛋白工程