陳君毅 孫興懷 笪翠弟 余曉波

·臨床研究·

干擾素α-2b對(duì)人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞纖維化作用的影響△

陳君毅 孫興懷 笪翠弟 余曉波

目的觀察干擾素α-2b(IFNα-2b)對(duì)人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞纖維化作用的影響。方法取青光眼患者濾過術(shù)中剪下的Tenon囊組織，在體外進(jìn)行成纖維細(xì)胞原代及傳代培養(yǎng)。采用半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，研究0、125、250、500和1 000 IU/mL濃度的IFNα-2b對(duì)體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β1、TGF-β2)、I型膠原蛋白、纖維連接蛋白表達(dá)的影響，以及IFNα-2b對(duì)TGF-β2促纖維化作用的影響。以人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參照，計(jì)算產(chǎn)物/GAPDH像素值。結(jié)果與對(duì)照組(TGF-β1：0.50±0.03；TGF-β2：0.53±0.10)相比，250～1 000 IU/mL濃度IFNα-2b組均能明顯抑制人Tenon囊成纖維細(xì)胞TGF-β1(0.45±0.18、0.45±0.13、0.37±0.11，Plt;0.05、0.05、0.01)和TGF-β2(0.47±0.12、0.48±0.21、0.42±0.14，Plt;0.01、0.05、0.01)表達(dá)。與對(duì)照組(I型膠原蛋白：0.68±0.08；纖維連接蛋白：0.72±0.09)相比，125～1 000 IU/mL濃度IFNα-2b組均能明顯抑制I型膠原蛋白(0.53±0.17、0.54±0.20、0.54±0.18、0.44±0.06，Plt;0.01)和纖維連接蛋白(0.68±0.14、0.67±0.19、0.64±0.07、0.58±0.11，Plt;0.01)表達(dá)。在10 μg/L TGF-β2刺激下，與對(duì)照組(Ⅰ型膠原蛋白：1.00±0.06；纖維連接蛋白：0.85±0.16)相比，1 000 IU/mL組IFNα-2b能夠顯著抑制I型膠原蛋白(0.78±0.09，Plt;0.01)表達(dá)；125～1 000 IU/mL組IFNα-2b均能顯著抑制纖維連接蛋白(0.74±0.22、0.68±0.18、0.68±0.15、0.63±0.10，Plt;0.01)表達(dá)。結(jié)論IFNα-2b能夠通過減少TGF-β1、TGF-β2的表達(dá)，減少Ⅰ型膠原蛋白及纖維連接蛋白的表達(dá)；還能夠拮抗外源性TGF-β2引起的Ⅰ型膠原蛋白及纖維連接蛋白表達(dá)升高。(中國眼耳鼻喉科雜志，2011，11：277-280)

干擾素α-2b； 成纖維細(xì)胞； 轉(zhuǎn)化生長因子β； Ⅰ型膠原蛋白； 纖維連接蛋白

通過對(duì)青光眼患者施行濾過性手術(shù)，建立人工房水引流路徑，可達(dá)到降低眼壓、控制青光眼的作用，但術(shù)后濾過通道的過度纖維化降低了房水引流的效率，導(dǎo)致患眼術(shù)后眼壓再次升高。成纖維細(xì)胞的過度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的過度產(chǎn)生是組織過度瘢痕化的主要原因[1]。目前臨床上普遍使用絲裂霉素C(Mitomycin C, MMC)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)來抑制濾過術(shù)后濾過通道成纖維細(xì)胞的過度增殖，取得一定的臨床療效，但這些藥物也造成了多種嚴(yán)重的并發(fā)癥[2-3]。因此，尋找既能有效抑制濾過通道瘢痕化，又能避免嚴(yán)重不良反應(yīng)藥物的研究成為該領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

干擾素α-2b(interferonα-2b，IFN α-2b)最初被作為抗病毒藥物治療全身或局部病毒感染，后來發(fā)現(xiàn)它能抑制兔晶狀體上皮細(xì)胞的生長[4]。臨床研究結(jié)果也表明，青光眼濾過術(shù)后使用IFNα-2b能提高手術(shù)的成功率[5]。但是IFNα-2b抑制人Tenon囊成纖維細(xì)胞纖維化的機(jī)制尚不清楚。本研究通過細(xì)胞培養(yǎng)的方法，研究IFNα-2b對(duì)人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)、ECM表達(dá)的影響，初步探討了IFNα-2b抗瘢痕形成的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人眼Tenon囊組織：來源于復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科收治的青光眼患者濾過術(shù)中剪下的Tenon囊組織，均獲得患者知情同意。主要試劑：達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)液(Dulbecco modified eagle medium，DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、胰蛋白酶(GIBCO公司)，小鼠抗人波形蛋白單克隆抗體、小鼠抗人角蛋白單克隆抗體(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，小鼠抗人成纖維細(xì)胞單克隆抗體(Antibody Diagnostica Inc.公司)，羊抗鼠Cy3熒光抗體(Sigma公司，美國)，重組人 TGF-β2(Ramp;D System公司)，RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司)，通用RT-PCR試劑盒(北京博大泰克公司產(chǎn)品)，2×Taq PCR MasterMix(北京天為時(shí)代公司)。藥物：注射用重組IFNα-2b凍干粉針劑(安徽安科生物工程股份有限公司，商品名：安達(dá)芬粉針)。

1.2 主要儀器及軟件 BIO-RAD iCycler PCR儀，BIO-RAD凝膠電泳成像分析系統(tǒng)，Quantity One凝膠電泳分析軟件，STATA 7.0統(tǒng)計(jì)軟件。

1.3 方法

1.3.1 人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 取青光眼患者術(shù)中剪下的Tenon囊組織，用含10%FBS的DMEM，以組織塊貼壁法培養(yǎng)。細(xì)胞融合80%～90%時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化傳代。小鼠抗人波形蛋白抗體、小鼠抗人角蛋白抗體和小鼠抗人成纖維細(xì)胞抗體免疫熒光染色鑒定。取第4～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 IFNα-2b對(duì)Tenon囊成纖維細(xì)胞TGF-β1、TGF-β2、Ⅰ型膠原蛋白(α2亞單位)和纖維連接蛋白表達(dá)的影響 采用半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptional polymerase chain reaction,RT-PCR)法。細(xì)胞以每孔105個(gè)，接種至6孔板，培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞融合生長達(dá)80%。培養(yǎng)細(xì)胞分為5組，加入IFNα-2b，使其終濃度分別為：0、125、250、500、1 000 IU/mL。48 h后用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS)洗滌3次，離心收集細(xì)胞，行RT-PCR。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠電泳成像分析系統(tǒng)掃描各電泳條帶的像素值，計(jì)算各產(chǎn)物/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyseraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)像素值比值，并照相記錄。相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物為PCR Marker DL-2000(Takara公司)。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 IFNα-2b對(duì)10 μg/L TGF-β2促纖維化作用的影響 按照上述方法設(shè)置IFNα-2b濃度，并同時(shí)在每孔中加入TGF-β2，終濃度為10 μg/L。48 h后用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，PBS洗滌3次，離心收集細(xì)胞，行RT-PCR。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 RT-PCR ①RNA提?。喊凑誖Neasy Mini Kit 使用說明分別提取上述細(xì)胞的總RNA。分光光度計(jì)測(cè)定RNA含量及純度，并調(diào)整濃度。②RT反應(yīng)：按照通用RT-PCR試劑盒使用說明的操作步驟，取總RNA 2 μg、5×反應(yīng)緩沖液4 μL、 dNTPs(10 mmol/L)1 μL、MMLV(200 U/μL)1 μL、Oligo(dT)16 1 μL、Rnasin(50 U/μL)，用雙蒸水補(bǔ)足至20 μL，37 ℃水浴2 h，95 ℃熱變性5 min，制備cDNA。③PCR體系：2×Taq PCR MasterMix 10 μL、上下游引物(2 mmol/L)各1 μL、RT產(chǎn)物1 μL、用雙蒸水補(bǔ)足至20 μL。④PCR引物見表1。

表1 PCR引物

2 結(jié)果

2.1 人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定 人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞于培養(yǎng)后5 d，開始由組織塊中游出增殖，呈梭形，3～4周融合成單層漩渦狀排列細(xì)胞。角蛋白免疫熒光染色陰性，波形蛋白免疫熒光染色陽性，成纖維細(xì)胞抗體染色陽性；以上符合人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞的特點(diǎn)[6]。

2.2 IFNα-2b對(duì)Tenon囊成纖維細(xì)胞TGF-β1、TGF-β2表達(dá)的影響 IFNα-2b濃度分別為0、125、250、500、1 000 IU/mL時(shí)，各產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1，各產(chǎn)物/GAPDH像素值比值見表2。TGF-β1/GAPDH像素值在250～1 000 IU/mL濃度IFNα-2b組分別為0.45±0.18、0.45±0.13、0.37±0.11，與對(duì)照組(IFNα-2b 0 IU/mL組)比值(0.50±0.03)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.78、8.78、42.44；Plt;0.05、0.05、0.01)。

TGF-β2/GAPDH像素值在250～1 000 IU/mL濃度IFNα-2b組分別為0.47±0.12、0.48±0.21、0.42±0.14，與對(duì)照組比值(0.53±0.10)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.6、8.83、39.95；Plt;0.01、0.05、0.01)。

圖1.不同濃度IFNα-2b對(duì)培養(yǎng)人Tenon囊成纖維細(xì)胞各產(chǎn)物表達(dá)的影響

IFNα?2b濃度(IU/mL)TGF?β1/GAPDHTGF?β2/GAPDHⅠ型膠原蛋白/GAPDH纖維連接蛋白/GAPDH00．50±0．030．53±0．100．68±0．080．72±0．091250．48±0．130．50±0．150．53±0．17b0．68±0．14b2500．45±0．18a0．47±0．12b0．54±0．20b0．67±0．19b5000．45±0．13a0．48±0．21a0．54±0．18b0．64±0．07b10000．37±0．11b0．42±0．14b0．44±0．06b0．58±0．11b

2.3 IFNα-2b對(duì)Tenon囊成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白和纖維連接蛋白表達(dá)的影響 Ⅰ型膠原蛋白/GAPDH像素值在125～1 000 IU/mL濃度IFNα-2b組分別為0.53±0.17、0.54±0.20、0.54±0.18、0.44±0.06，與對(duì)照組比值(0.68±0.08)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.58、11.82、12.10、37.12；Plt;0.01)。纖維連接蛋白/GAPDH像素值在125～1 000 IU/mL濃度IFNα-2b組分別為0.68±0.14、0.67±0.19、0.64±0.07、0.58±0.11，與對(duì)照組比值(0.72±0.09)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.52、80.53、49.25、92.89；Plt;0.01)。

2.4 TGF-β2刺激下IFNα-2b對(duì)Tenon囊成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白和纖維連接蛋白表達(dá)的影響 培養(yǎng)時(shí)同時(shí)加入TGF-β2(10μg/L)和IFNα-2b(濃度分別為：0、125、250、500、1 000 IU/mL)，各產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2，各產(chǎn)物/GAPDH像素值比值見表3。加入TGF-β2(10 μg/L)后，Ⅰ型膠原蛋白及纖維連接蛋白的表達(dá)均較未加TGF-β2組明顯升高(Ⅰ型膠原蛋白 /GAPDH、纖維連接蛋白 /GAPDH分別從0.68±0.28、0.72±0.22升高到1.00±0.06、0.85±0.16，分別升高了47%和18%)。Ⅰ型膠原蛋白/GAPDH像素值在1 000 IU/mL濃度IFNα-2b組為0.78±0.09，與對(duì)照組比值(1.00±0.06)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=47.36；Plt;0.01)。纖維連接蛋白/GAPDH像素值在125～1 000 IU/mL濃度IFNα-2b組分別為0.74±0.22、0.68±0.18、0.68±0.15、0.63±0.10，與對(duì)照組比值(0.85±0.16)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=116.95、75.83、70.35、137.52；Plt;0.01)。

圖2.不同濃度IFNα-2b加TGF-β2(10 μg/L)對(duì)培養(yǎng)人Tenon囊成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白、纖維連接蛋白表達(dá)的影響

表3 不同濃度IFNα-2b加TGF-β2(10 μg/L)后對(duì)培養(yǎng)人Tenon囊成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白、纖維連接蛋白/GAPDH像素值比值的影響

3 討論

青光眼濾過手術(shù)是目前藥物無法控制青光眼的主要治療手段。雖然近年來抗青光眼的顯微手術(shù)和藥物調(diào)節(jié)治療已取得很大進(jìn)展，但青光眼濾過性手術(shù)2年的失敗率仍達(dá)15%～30%。失敗的主要原因是，手術(shù)區(qū)濾過通道成纖維細(xì)胞增殖、瘢痕形成，使濾過泡功能減弱[1]。因此，減少成纖維細(xì)胞增殖和ECM分泌是控制青光眼濾過術(shù)后瘢痕形成的重要環(huán)節(jié)。

TGF-β家族由一組與細(xì)胞增殖、移行、分化及凋亡等功能密切相關(guān)的細(xì)胞因子組成，至今已發(fā)現(xiàn)TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3 3種具有同源性的亞型[7]。這3 種亞型在人眼前段均有表達(dá)，其中以TGF-β1和TGF-β2濃度最高[8]。體外實(shí)驗(yàn)中加入TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3均能刺激Tenon囊成纖維細(xì)胞增殖[9]。TGF-β1、TGF-β2能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化[10]。在小鼠的角鞏膜緣創(chuàng)傷模型中，發(fā)現(xiàn)術(shù)后2 d成纖維細(xì)胞開始增多。在傷口愈合過程中，TGF-β1、TGF-β2出現(xiàn)早且保持高表達(dá)[11]。運(yùn)用重組的單克隆TGF-β2抗體治療青光眼濾過術(shù)后的濾過通道瘢痕形成取得了成功[12]，因此，認(rèn)為TGF-β與青光眼濾過術(shù)后濾過通道瘢痕形成有密切關(guān)系。

IFNα-2b能夠抑制成纖維細(xì)胞釋放TGF-β等刺激膠原合成、成纖維細(xì)胞生長的細(xì)胞因子，從而抑制成纖維細(xì)胞增殖和向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化及膠原的合成[13-14]。本實(shí)驗(yàn)中，250～1 000 IU/mL濃度IFNα-2b組與對(duì)照組相比，均能明顯抑制人Tenon囊成纖維細(xì)胞TGF-β1、TGF-β2表達(dá)，而且這種抑制作用呈濃度依賴性，以1 000 IU/mL濃度組抑制作用最顯著。

本實(shí)驗(yàn)中，125～1 000 IU/mL濃度IFNα-2b組與對(duì)照組相比，Ⅰ型膠原蛋白及纖維連接蛋白表達(dá)顯著降低(Plt;0.01)，說明IFNα-2b對(duì)人Tenon囊成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白及纖維連接蛋白表達(dá)有明顯抑制作用。這種抑制Ⅰ型膠原蛋白、纖維連接蛋白等ECM合成的作用，可能與IFNα-2b通過降低成纖維細(xì)胞TGF-β的表達(dá)，從而抑制TGF-β對(duì)成纖維細(xì)胞的自分泌作用有關(guān)。

IFNα-2b對(duì)人Tenon囊成纖維細(xì)胞在外源性TGF-β刺激作用下的影響罕見報(bào)道。房水中存在豐富的TGF-β2[15]，TGF-β能刺激Tenon囊成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化[10-11]。濾過性手術(shù)使得房水中的TGF-β2能夠直接接觸手術(shù)創(chuàng)口，促進(jìn)了濾過泡瘢痕化。本實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)液中加入10 μg/L TGF-β2，觀察IFNα-2b對(duì)人Tenon囊成纖維細(xì)胞ECM表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，加入10 μg/L TGF-β2后，Ⅰ型膠原蛋白及纖維連接蛋白的表達(dá)均較未加TGF-β2組明顯升高(分別升高了47%和18%)。與對(duì)照組相比，1 000 IU/mL的IFNα-2b能夠明顯抑制Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)(Plt;0.01)；125～1 000 IU/mL的IFNα-2b能夠顯著抑制纖維連接蛋白的表達(dá)(Plt;0.01)。證明IFNα-2b對(duì)外源性TGF-β2引起的ECM表達(dá)升高有明顯抑制作用。

綜上所述，IFNα-2b能夠減少體外培養(yǎng)人Tenon囊成纖維細(xì)胞TGF-β1、TGF-β2的表達(dá)，從而減少ECM(主要是Ⅰ型膠原蛋白及纖維連接蛋白)表達(dá)；另外IFNα-2b還能夠拮抗外源性TGF-β2引起的Ⅰ型膠原蛋白及纖維連接蛋白表達(dá)升高。因此，IFNα-2b可能成為一種比較理想的青光眼濾過術(shù)后抗瘢痕形成的藥物。

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2011-06-17)

(本文編輯 諸靜英)

Investigationofinterferonα-2binthefibrosisofhumanTenon′scapsulefibroblasts

CHENJun-yi,SUNXing-huai,DACui-di，YUXiao-bo.DepartmentofOphthalmology,EyeEarNoseandThroatHospital,FudanUniversity,Shanghai200031,China

Corresponding author：SUN Xing-huai, Email: xhsun@shmu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the effect of interferon α-2b (IFNα-2b) in the fibrosis of human Tenon′s fibroblasts.MethodsFibroblasts were cultured from Tenon′s tissue of a glaucoma patient after trabeculectomy. The effects of IFNα-2b on the expression of transforming growth factor β1(TGF-β1), TGF-β2, collagen type I and fibronectin mRNA were determined by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis. The effects of IFNα-2b on collagen type I and fibronectin mRNA with the stimulation of TGF-β2 (10 μg/L) were also studied. IFNα-2b was added to the culture medium at final concentrations of 0, 125, 250, 500 and 1 000 IU/mL respectively.ResultsThe expressions of TGF-β1, TGF-β2 mRNA significantly decreased after the addition of 250～1 000 IU/mL IFNα-2b. The expressions of collagen type I and fibronectin also significantly decreased at the 125～1 000 IU/mL IFNα-2b. The increasing expressions of collagen type I and fibronectin mRNA stimulated by 10 μg/L TGF-β2 could be weakened by 1 000 IU/mL and 125 to 1 000 IU/mL IFNα-2b respectively.ConclusionsIFNα-2b might inhibit the expression of collagen type I and fibronectin mRNA, through decreasing the expression of TGF-β1 and TGF-β2 mRNA. In addition, IFNα-2b could also weaken the increasing expressions of collagen type I and fibronectin mRNA stimulated by 10 μg/L TGF-β2. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2011,11:277-280)

Interferon α-2b; Fibroblasts; Transforming growth factor β; Collagen type I; fibronectin

上海市浦東新區(qū)科技發(fā)展基金(PKJ2006-Y10)

上海市衛(wèi)生局青年科研項(xiàng)目(2008Y092)

復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科 衛(wèi)生部近視眼重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 200031

孫興懷(Email: xhsun@shmu.edu.cn)