王 耀 耀， 朱 蓓 薇， 董 秀 萍， 葉 文 秀， 肖 桂 華

（大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 大連 116034）

0 引 言

鮑魚屬軟體動(dòng)物門、腹足綱、鮑科，其營(yíng)養(yǎng)豐富、味道鮮美，具有很高的食用價(jià)值。鮑魚的可食用部分主要是腹足，腹足中與殼肌相連的中間部位肌原纖維含量較高，而腹足邊緣部位膠原蛋白的含量相對(duì)較高［1］。關(guān)于蛋白質(zhì)的研究表明，肌原纖維蛋白是一類以鹽溶性蛋白為主的蛋白質(zhì)群，是具有重要生物學(xué)功能的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，與肉制品的流變學(xué)特性如保水性、彈性、質(zhì)地等有著密切的關(guān)系［2］。另?yè)?jù)報(bào)道，濁度可以反映蛋白質(zhì)的聚集程度。溶液中蛋白質(zhì)聚集形成顆粒的數(shù)目越多、體積越大，濁度就越大［3］。肌原纖維蛋白的聚集程度影響其形成凝膠的結(jié)構(gòu)［4］，進(jìn)而影響肉類產(chǎn)品的品質(zhì)。蛋白質(zhì)的溶解度影響其熱誘導(dǎo)凝膠性質(zhì)、起泡性以及肉品的保水性［5］，同時(shí)溶解度可作為制品過熟程度的判斷指標(biāo)［6］。溶液的溫度、pH 和離子強(qiáng)度能夠影響蛋白質(zhì)的聚集程度和溶解度，進(jìn)而影響其功能性質(zhì)和加工特性。由于鮑魚腹足中肌原纖維蛋白含量很高，其性質(zhì)與鮑魚產(chǎn)品的品質(zhì)有直接關(guān)系，因此，對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行研究有重要意義，但關(guān)于鮑魚腹足肌原纖維蛋白性質(zhì)的研究國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道。本文將研究鮑魚腹足肌原纖維蛋白所包含蛋白質(zhì)的種類，并考察溫度、pH 以及離子強(qiáng)度對(duì)鮑魚腹足肌原纖維蛋白溶液濁度和溶解度的影響，以期對(duì)鮑魚的加工以及鮑魚產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鮮活皺紋盤鮑，（75±5）g，購(gòu)于大連長(zhǎng)興海鮮市場(chǎng)。

化學(xué)試劑與標(biāo)準(zhǔn)蛋白：磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、二硫蘇糖醇（DTT）、無水硫酸銅、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉等均為分析純；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品，寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

T25數(shù)顯勻漿機(jī)，德國(guó)IKA；Z-323K 冷凍離心機(jī)，德國(guó)HERMLE；UV-2100型紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；pH 計(jì)，上海鵬順科學(xué)儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；JM-250型電泳儀，大連捷邁科貿(mào)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 鮑魚腹足肌原纖維蛋白的提取方法

鮑魚腹足肌原纖維蛋白的提取參照Paredi等［7］的方法進(jìn)行改進(jìn)。將鮑魚去殼、去內(nèi)臟，取腹足閉殼肌及其相連部分洗凈，切碎，打漿30s，加入其20～30 倍體積（mL／g）的水洗液（40 mmol／L NaCl，0.5 mmol／L DTT，1 mmol／L MgCl2，10mmol／L 的 磷 酸 鹽 緩 沖 液pH 7.0），在5 000r／min勻漿4min。為了防止勻漿液過熱，每勻漿40s暫停20s。所得勻漿物在10 000r／min（4℃）離心5min。將所得沉淀按照上述步驟再重復(fù)處理兩次，向第3次所得沉淀中加入10倍體積（mL／g）的提取液（0.6mol／L NaCl，10mmol／L 的磷酸鹽緩沖液pH 7.0），4 000r／min勻漿4min，然后勻漿物在13 500r／min（4 ℃）離心25 min，所得上清即為鮑魚腹足肌原纖維蛋白溶液。

1.3.2 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測(cè)定方法

雙縮脲法［8］測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，用牛血清蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.3.3 鮑魚腹足肌原纖維蛋白的SDS-PAGE方法

參照Laemmli［9］的方法對(duì)鮑魚腹足肌原纖維蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 分析。將鮑魚腹足肌原纖維蛋白與樣品緩沖溶液按體積比1∶1 混合，100℃水浴加熱5min。選取12%的分離膠和5%的濃縮膠。電泳時(shí)初始電壓為90V，當(dāng)樣品前沿剛好進(jìn)入分離膠后將電壓提高到120V，電泳時(shí)間約3h。使用Gel-Pro analyzer 4軟件分析電泳圖像。

1.3.4 鮑魚腹足肌原纖維蛋白的熱處理方法

將一定量的肌原纖維蛋白溶液加入到配有旋蓋的玻璃試管中，旋緊旋蓋后置于水浴鍋中加熱。用溫度計(jì)檢測(cè)試管中心溫度，控制升溫速率為1 ℃／min，使樣品的溫度從30 ℃升高到90 ℃。考察溫度點(diǎn)為30、40、50、60、70、80和90℃，當(dāng)溫度達(dá)到相應(yīng)值時(shí)立即取出試管并流水冷卻。

1.3.5 濁度測(cè)定方法

參照文獻(xiàn)［10］的方法，調(diào)整肌原纖維蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為2.0mg／mL，在不同條件處理后靜置過夜，測(cè)定A350。

1.3.6 溶解度測(cè)定方法

測(cè)定濁度后的蛋白溶液在4 ℃、13 500r／min下離心25min，參照文獻(xiàn)［11］的方法測(cè)定蛋白溶解度。

2 結(jié)果與討論

2.1 鮑魚腹足肌原纖維蛋白的SDS-PAGE結(jié)果

通過SDS-PAGE 可知鮑魚腹足肌原纖維蛋白主要含有肌球蛋白重鏈（201ku）、副肌球蛋白（96 ku）、肌 動(dòng) 蛋 白（46 ku）和 原 肌 球 蛋 白（38ku），質(zhì) 量 分 數(shù) 分 別 為21.7%、35.8%、27.4%和6.6%，如圖1 所示。此結(jié)果與Ehara等［12］對(duì)鮑魚腹足肌原纖維蛋白的研究結(jié)果接近。另外，鮑魚腹足肌原纖維蛋白與脊椎動(dòng)物［13-14］肌原纖維蛋白相比副肌球蛋白含量相對(duì)較高，這可能與物種差異有關(guān)。

圖1 鮑魚腹足肌原纖維蛋白的組成Fig.1 The composition of abalone myofibrillar protein

2.2 溫度對(duì)鮑魚腹足肌原纖維蛋白濁度和溶解度的影響

在緩沖液pH 為7.0，離子強(qiáng)度為0.6mol／L（NaCl），蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為2.0 mg／mL 的條件下考察溫度對(duì)鮑魚腹足肌原纖維蛋白濁度和溶解度的影響，見圖2。

圖2 溫度對(duì)鮑魚腹足肌原纖維蛋白濁度和溶解度的影響Fig.2 Effect of heating temperature on turbidity and solubility of abalone myofibrillar protein

從圖2可知，鮑魚腹足肌原纖維蛋白的濁度隨加熱溫度升高而上升。30～40 ℃時(shí)，鮑魚腹足肌原纖維蛋白的濁度基本保持不變，說明蛋白還沒有發(fā)生明顯變性聚集。40～50 ℃時(shí)濁度明顯上升，說明蛋白變性聚集程度急劇增加。Paredi等［15］報(bào)道扇貝肌球蛋白的變性溫度為41.7～55.0 ℃，因此鮑魚肌原纖維蛋白濁度在40 ℃時(shí)開始增加可能是由于肌球蛋白的變性聚集引起。溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，濁度（A350）達(dá)到1.0，說明溶液中已經(jīng)產(chǎn)生明顯的蛋白聚集物。50～90 ℃時(shí)，隨加熱溫度升高濁度緩慢上升，說明蛋白聚集物的結(jié)構(gòu)變得致密。因此，當(dāng)升溫速率一定時(shí)，聚集物生成過程中濁度的上升較聚集物結(jié)構(gòu)變得致密過程中濁度的上升更為明顯。

30～40 ℃時(shí)，鮑魚腹足肌原纖維蛋白溶解度變化不明顯，說明蛋白幾乎沒有發(fā)生變性。40～50 ℃時(shí)，溶解度急劇降低，說明蛋白急劇變性。50～90 ℃時(shí)，隨加熱溫度升高溶解度緩慢降低，說明部分未變性的蛋白緩慢變性。加熱促使鮑魚肌原纖維蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，疏水基團(tuán)暴露，暴露的疏水基團(tuán)發(fā)生聚集，從而導(dǎo)致蛋白沉淀、溶解度降低。

2.3 pH 對(duì)鮑魚腹足肌原纖維蛋白濁度和溶解度的影響

在離子強(qiáng)度為0.6 mol／L（NaCl），蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為2.0 mg／mL，溫度為室溫下（20～25 ℃）考察pH 對(duì)鮑魚腹足肌原纖維蛋白濁度和溶解度的影響，見圖3。從圖3 可知，當(dāng)pH 在4.0、4.5和5.0時(shí)，鮑魚腹足肌原纖維蛋白溶液濁度較大（A350＞1.3）且有波動(dòng)，說明蛋白發(fā)生了明顯聚集而且聚集物的結(jié)構(gòu)不均勻，費(fèi)英等［4］同樣發(fā)現(xiàn)在酸性條件下肌原纖維蛋白形成的凝膠不均勻且存在聚合物。pH 在5.5～6.0時(shí)蛋白濁度急劇下降，說明蛋白的聚集程度也急劇下降。pH 高于6.0時(shí)，蛋白基本沒發(fā)生聚集，因此濁度較低且變化不明顯。鮑魚腹足肌原纖維蛋白在堿性和中性條件下基本不發(fā)生聚集，在酸性條件下聚集程度較大，pH 在5.5時(shí)聚集程度最大。

圖3 pH 對(duì)鮑魚腹足肌原纖維蛋白濁度和溶解度的影響Fig.3 Effect of pH on turbidity and solubility of abalone myofibrillar protein

pH 低于5.5 時(shí)，鮑魚腹足肌原纖維蛋白的溶解度較低，且隨pH 升高溶解度變化不明顯；pH 從5.5升高到6.0的過程中，溶解度急劇升高；pH 超過6.5以后，溶解度變化不大。通常當(dāng)溶液的pH 靠近蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)所帶凈電荷減少、溶解度明顯降低，另外pH 對(duì)豬肉［16］、魚肉［17］的肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化有不同程度的影響，因此當(dāng)溶液的pH 從6.0降低到5.5時(shí)，鮑魚腹足肌原纖維蛋白所帶凈電荷和空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致溶解度降低。

2.4 離子強(qiáng)度對(duì)鮑魚腹足肌原纖維蛋白濁度和溶解度的影響

在pH 為7.0，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為2.0mg／mL，溫度為室溫（20～25 ℃）下考察離子強(qiáng)度（NaCl）對(duì)鮑魚腹足肌原纖維蛋白濁度和溶解度的影響，見圖4。從圖4可知，離子強(qiáng)度從0.2 mol／L 升高到0.4mol／L的過程中，鮑魚腹足肌原纖維蛋白的濁度急劇下降；當(dāng)離子強(qiáng)度大于0.4 mol／L時(shí)，隨離子強(qiáng)度的增加濁度變化不明顯。濁度的降低反映了蛋白質(zhì)聚集程度的降低，因此鮑魚肌原纖維蛋白在低離子強(qiáng)度下容易發(fā)生聚集，在高離子強(qiáng)度下聚集程度較低或者基本不發(fā)生聚集，這與徐幸蓮等［11］對(duì)兔骨骼肌肌球蛋白溶液濁度的研究結(jié)果一致。

離子 強(qiáng) 度 從0.2 mol／L 升 高 到0.4 mol／L時(shí)，鮑魚腹足肌原纖維蛋白的溶解度急劇升高；當(dāng)離子強(qiáng)度大于0.4mol／L 時(shí)，隨離子強(qiáng)度增加溶解度變化不明顯。這與韓敏義等［18］研究兔肌球蛋白獲知的溶解度變化趨勢(shì)有相似性。

圖4 離子強(qiáng)度對(duì)鮑魚腹足肌原纖維蛋白濁度和溶解度的影響Fig.4 Effect of ionic strength on turbidity and solubility of abalone myofibrillar protein

3 結(jié) 論

（1）鮑魚腹足肌原纖維蛋白主要由肌球蛋白、副肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白和原肌球蛋白組成，其中副肌球蛋白含量相對(duì)較高。

（2）鮑魚腹足肌原纖維蛋白溶液濁度隨溫度升高而上升，隨pH 和離子強(qiáng)度的升高而下降；溶解度隨溫度升高而降低，隨pH 和離子強(qiáng)度的升高而升高。

（3）當(dāng) 溶 液pH 高 于6.0，離 子 強(qiáng) 度 大 于0.4mol／L時(shí)，鮑魚腹足肌原纖維蛋白溶解度較高。當(dāng)溫度高于50℃時(shí)，鮑魚腹足肌原纖維蛋白溶解度較低。

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