黃鳳婷 張世能 梁愛(ài)心 峗淑莉 莊曉虹 陳文博

·論著·

阻斷Hedgehog信號(hào)通路對(duì)人胰腺癌干細(xì)胞自我更新的影響

黃鳳婷 張世能 梁愛(ài)心 峗淑莉 莊曉虹 陳文博

目的觀察Hedgehog信號(hào)通路特異阻斷劑環(huán)巴明對(duì)胰腺癌干細(xì)胞自我更新的影響。方法應(yīng)用0.5、1、2、5、10 μmol/L環(huán)巴明處理胰腺癌PANC1干細(xì)胞、PANC1貼壁細(xì)胞和永生化胰腺導(dǎo)管上皮H6C7細(xì)胞 24、48、72 h。采用實(shí)時(shí)RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞Smo及Gli1 mRNA表達(dá)；CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡。結(jié)果10 μmol/L環(huán)巴明處理72 h后，PANC1干細(xì)胞、PANC1細(xì)胞和H6C7細(xì)胞的Smo mRNA表達(dá)量分別為1、0.83、2.61； Gli1 mRNA為57.27、26.35、1；生長(zhǎng)抑制率分別為(37.85±13.69)%、(8.53±4.43)%、(43.55±28.98)%。與PANC1細(xì)胞比較，PANC1干細(xì)胞的Smo、Gli1 mRNA 表達(dá)顯著增加，生長(zhǎng)抑制率亦顯著增強(qiáng)(P值<0.05或<0.01)。經(jīng)10 μmol/L環(huán)巴明處理72 h，PANC1干細(xì)胞G1期比例從(67.41±6.35)%顯著降至(36.53±6.03)% (P<0.05)，細(xì)胞凋亡率從(10.95±5.68)%降至(5.73±1.42)% (P>0.05)；PANC1細(xì)胞G1期比例從(67.64±6.88)%顯著降至(53.13±1.10)% (P<0.05)，細(xì)胞凋亡率從(12.08±4.12)%降至(5.66±1.33)% (P>0.05)；而H6C7細(xì)胞的G1期比例及凋亡無(wú)明顯變化。結(jié)論環(huán)巴明阻斷Hedgehog信號(hào)通路可抑制PANC1干細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與細(xì)胞凋亡無(wú)關(guān)。

胰腺腫瘤； 干細(xì)胞； Hedgehog信號(hào)通路； 自我更新

Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與胰腺胚胎發(fā)育密切相關(guān)，Bar等[1]和Zhao等[2]報(bào)道，腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞等腫瘤干細(xì)胞中存在此通道，它與細(xì)胞自我更新和多向分化密切相關(guān)，而且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。我們的前期研究[3-4]已成功培養(yǎng)出具有腫瘤干細(xì)胞樣特性的胰腺癌干細(xì)胞。本研究旨在觀察環(huán)巴明(cyclopamine)特異阻斷Hedgehog信號(hào)通路對(duì)人胰腺癌干細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及凋亡的的影響。

材料與方法

一、細(xì)胞株

人胰腺癌細(xì)胞系PANC1由中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室保存；永生化胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞H6C7由加拿大安大略癌癥研究所Tsao教授惠贈(zèng)。PANC1常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基；H6C7培養(yǎng)于K-SFM混合培養(yǎng)基；PANC1細(xì)胞懸浮培養(yǎng)于含20 ng/ml EGF、5 μg/ml胰島素、0.4%BSA、1∶50 B27的DMEM-F12(1∶1) 培養(yǎng)基中獲得PANC1干細(xì)胞。

二、實(shí)時(shí) RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞Smo、Gli1 mRNA

用Trizol法提取PANC1干細(xì)胞、PANC1貼壁細(xì)胞和H6C7的細(xì)胞總RNA，實(shí)時(shí) RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞Smo、Gli1 mRNA表達(dá)，以18S rRNA為內(nèi)參照。Smo上游引物5′-CATCCCTGACTGTGAGATCA-3′，下游引物5′-CACCATCTTGGTGACATGCT-3′，擴(kuò)增片段370 bp；Gli1上游引物5′-CCATACATGTGTGAGCACGA-3′,下游引物5′-GGCACAGTCAGTCTGCTTT-3′，擴(kuò)增片段308 bp。PCR儀為7300型(美國(guó)ABI公司)。RT反應(yīng)條件：30℃ 10 min，42℃ 60 min，72℃ 10 min；PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 10 s、60℃ 15 s、72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。相對(duì)表達(dá)量(RQ)=2-△△Ct。

三、CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

收集培養(yǎng)12～15 d的PANC1干細(xì)胞，消化成單細(xì)胞懸液，按每孔3×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，立即分別加入到終濃度為0、0.5、1、2、5、10 μmol/L環(huán)巴明的培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PANC1貼壁細(xì)胞及H6C7細(xì)胞，按每孔3×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)24 h后，換含0、0.5、1、2、5、10 μmol/L環(huán)巴明的培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。每組細(xì)胞均設(shè)2個(gè)復(fù)孔。三種細(xì)胞分別于培養(yǎng)24、48、72 h后每孔加入10 μl CCK-8試劑，繼續(xù)孵育4 h，測(cè)吸光度值A(chǔ)450/A630比值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。抑制率(%)=(A對(duì)照組-A實(shí)驗(yàn)組)/A對(duì)照組×100%。

四、細(xì)胞周期檢測(cè)

收集用10 μmol/L環(huán)巴明處理72 h的PANC1干細(xì)胞、PANC1貼壁細(xì)胞及H6C7細(xì)胞，消化成單細(xì)胞懸液，70%乙醇固定18 h，加入RNase至終濃度為50 μg/ml及PI染液至終濃度為50 μg/ml，37℃避光孵育30 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀(FACSCalibur,美國(guó)Becton Dickinson公司)檢測(cè)細(xì)胞周期。

五、細(xì)胞凋亡檢測(cè)

收集用10 μmol/L環(huán)巴明處理72 h的PANC1干細(xì)胞、PANC1貼壁細(xì)胞及H6C7細(xì)胞，消化成單細(xì)胞懸液，1000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗2次，重懸細(xì)胞為106個(gè)/ml，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、細(xì)胞Smo、Gli1 mRNA表達(dá)

PANC1干細(xì)胞、PANC1貼壁細(xì)胞和H6C7細(xì)胞Smo mRNA的表達(dá)量分別為1、0.83、2.61；Gli1 mRNA表達(dá)量分別為57.27、26.35、1。其中PANC1干細(xì)胞Smo mRNA表達(dá)是PANC1貼壁細(xì)胞的154.76倍，H6C7細(xì)胞Smo mRNA表達(dá)是PANC1貼壁細(xì)胞的403.72倍；PANC1干細(xì)胞Gli1 mRNA表達(dá)是PANC1貼壁細(xì)胞的6.94倍，H6C7細(xì)胞Gli1 mRNA表達(dá)是PANC1貼壁細(xì)胞的0.14倍。與PANC1細(xì)胞比較，PANC1干細(xì)胞的Smo、Gli1 mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.05)。

二、環(huán)巴明對(duì)細(xì)胞增殖的影響

PANC1干細(xì)胞、PANC1及H6C7細(xì)胞經(jīng)0.5、1、2、5、10 μmol/L環(huán)巴明作用后，細(xì)胞基本上呈劑量、時(shí)間依賴(lài)性地出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制。10 μmol/L環(huán)巴明作用72 h后，PANC1干細(xì)胞和H6C7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為(37.85±13.69)%和(43.55±28.98)%，兩組間差異顯著(P<0.05)，且均顯著高于PANC1細(xì)胞(8.53±4.43)%的生長(zhǎng)抑制率 (P<0.01)。

三、環(huán)巴明對(duì)細(xì)胞周期的影響

10 μmol/L環(huán)巴明作用72 h后，PANC1干細(xì)胞G1期比例從(67.41±6.35)%顯著降至(36.53±6.03)% (P<0.05)； PANC1細(xì)胞從(67.64±6.88)%顯著降至(53.13±1.10)% (P<0.05)；H6C7細(xì)胞從(62.85±4.83)%到(68.22±10.16)%，無(wú)明顯變化(圖1)。

a、c、e為環(huán)巴明處理前的細(xì)胞周期；b、d、f為10 μmol/L環(huán)巴明處理72 h后的細(xì)胞周期

圖1環(huán)巴明處理前后三種細(xì)胞的細(xì)胞周期

四、環(huán)巴明對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

10 μmol/L環(huán)巴明處理72 h后，PANC1干細(xì)胞凋亡率從(10.95±5.68)%降至(5.73±1.42)%，PANC1細(xì)胞從(12.08±4.12)%降至(5.66±1.33)%，H6C7細(xì)胞從(2.14±1.47)%降到(1.72±1.08)%，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

討 論

自我更新是腫瘤干細(xì)胞的重要生物學(xué)特性之一，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Liu等[5]研究表明Hedgehog信號(hào)通路可能參與腫瘤干細(xì)胞自我更新機(jī)制，該通路的異常表達(dá)或激活可能是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。環(huán)巴明是Hedgehog信號(hào)通路中Smo蛋白的特異抑制劑，可通過(guò)環(huán)巴明 阻斷Hedgehog信號(hào)通路。Sonic Hedgehog存在于70%的胰腺癌中，與胰腺癌關(guān)系密切[6]，但在胰腺癌干細(xì)胞中的研究國(guó)內(nèi)外甚少。我們前期研究[4]成功采用懸浮法培養(yǎng)PANC1干細(xì)胞，并通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有腫瘤干細(xì)胞樣特性，在此基礎(chǔ)上采用實(shí)時(shí) RT-PCR法檢測(cè)PANC1干細(xì)胞Smo和Gli1 mRNA表達(dá)，證實(shí)了PANC1干細(xì)胞存在Sonic Hedgehog信號(hào)通路。

增殖能力是腫瘤干細(xì)胞自我更新能力的表現(xiàn)之一。本實(shí)驗(yàn)中，PANC1干細(xì)胞經(jīng)10 μmol/L環(huán)巴明處理72 h后，增殖能力明顯下降，這與Peacock等[7]用環(huán)巴明處理膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和骨髓瘤干細(xì)胞的結(jié)果相符。腫瘤干細(xì)胞是一種慢周期細(xì)胞[8]，細(xì)胞中以G0/G1期為主。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，環(huán)巴明處理前，PANC1干細(xì)胞以G0/G1期為主，經(jīng)10 μmol/L 環(huán)巴明處理72 h后，PANC1干細(xì)胞G0/G1期比例明顯下降，自我更新能力明顯抑制，但細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示環(huán)巴明阻斷Hedgehog信號(hào)通路抑制胰腺癌干細(xì)胞的自我更新并非通過(guò)影響細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

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[3] 黃鳳婷，張世能，黃奕俊，等.人胰腺癌細(xì)胞系SW1990中腫瘤干細(xì)胞樣側(cè)群細(xì)胞的分離及生物學(xué)特性研究.中華胰腺病雜志,2008,8:372-375.

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2010-04-07)

(本文編輯：呂芳萍)

Effectsonselfrenewalofpancreaticcancerstemcellsbyinhibitinghedgehogsignalpathway

HUANGFeng-ting,ZHANGShi-neng,LIANGAi-xin,WEIShu-li,ZHUANGXiao-hong,CHENWen-bo.

DepartmentofGastroenterology,SecondAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China

ZHANGShi-neng,Email:shinengz2010@163.com

ObjectiveTo investigate the effects on self-renewal of pancreatic cancer stem cells by inhibiting hedgehog signaling pathway through cyclopamine.MethodsPANC1 stem cells, PANC1 adherent cells and immortalized pancreatic ductal epithelial H6C7 cells were treated with 0.5, 1, 2, 5, 10 mol/L of cyclopamine for 24, 48, 72 h. The expression of Smo mRNA and Gli1 mRNA were detected by real-time PCR. Cell growth viability was measured by CCK 8. Cell cycle and apoptosis were determined by flow cytometry.ResultsSeventy-two hours after cyclopamine treatment, the Smo mRNA expressions of PANC1 stem cells, PANC1 adherent cells and H6C7 cells were 1,0.83 and 2.61; the expressions of Gli mRNA were 57.27,26.35,1; the inhibitory rates were (37.85±13.69)%, (8.53±4.43)%, (43.55±28.98)%. Compared with PANC1, the expressions of Smo mRNA, Gli1 mRNA and the inhibitory rate of PANC1 stem cells significantly increased (P<0.05). The proportion of G1stage of PANC1 stem cells significantly decreased from (67.41±6.35)% to (36.53±6.03)% (P<0.05), and the apoptosis decreased from (10.95±5.68)% to (5.73±1.42)% (P>0.05). The proportion of G1stage of PANC1 cells significantly decreased from (67.64 ± 6.88)% to (53.13±1.10)%(P<0.05); the apoptosis decreased

from (12.08±4.12)% to (5.66±1.33)%(P>0.05). While both the proportion of G1stage and apoptosis of H6C7 cells was not significantly different.ConclusionsCyclopamine can inhibit the proliferation of PANC1 stem cells via blocking hedgehog signal pathway, and the mechanism may not be associated with cell apoptosis.

Pancreatic neoplasm； Stem cells； Hedgehog signal pathway； Self-renewal

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.02.005

廣東省自然科學(xué)基金(8151008901000139)；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(B2009066)

510120 廣州，中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科

黃鳳婷，Email：rachelh1982@163.com

張世能，Email：shinengz2010@163.com