吳漢青 吳河水 朱世凱 張建軍 楊智勇 王春友

·論著·

Toll樣受體9在胰腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義

吳漢青 吳河水 朱世凱 張建軍 楊智勇 王春友

目的檢測(cè)Toll樣受體9(TLR9)在胰腺癌組織中的表達(dá)，探討其臨床意義。方法采用實(shí)時(shí)定量PCR法、 蛋白質(zhì)印跡法及免疫組化法檢測(cè)30例胰腺癌及其相應(yīng)癌旁組織、10例正常胰腺組織中TLR9的表達(dá)，分析胰腺癌組織TLR9表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果以正常胰腺組織作為對(duì)照，胰腺癌組織TLR9 mRNA表達(dá)倍數(shù)為2.32(1.41～3.22)，癌旁組織為1.23(1.18～1.28)，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。胰腺癌組織TLR9蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為73.3%(22/30)，癌旁組織為33.3%(10/30)，正常胰腺組織為20.0%(2/10)，三者的TLR9相對(duì)表達(dá)量分別為0.780±0.026、0.400±0.018、0.173±0.043，三組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)。胰腺癌組織TLR9高表達(dá)與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。結(jié)論胰腺癌組織高表達(dá)TLR9，它可能參與胰腺癌的惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程。

胰腺腫瘤； Toll樣受體9； 表達(dá)； 病理學(xué)，臨床

Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是一新發(fā)現(xiàn)的古老的受體家族，不僅參與天然免疫，而且與特異性免疫、免疫耐受和某些疾病防治密切相關(guān)。近來(lái)發(fā)現(xiàn)Toll樣受體可能參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[1]。TLR9作為該家族重要成員在很多腫瘤中高表達(dá)，但是否與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)尚不清楚。本研究檢測(cè)胰腺癌組織TLR9的表達(dá)，探討其與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，以期為胰腺癌的臨床治療提供新的依據(jù)。

資料與方法

一 、臨床資料

獲取華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院胰腺外科中心2008年12月至2009年8月手術(shù)治療的30例人新鮮胰腺癌組織及距腫瘤邊緣1～2 cm的相應(yīng)癌旁組織，另取10例行胰腺部分切除的非腫瘤患者的胰腺組織。所有標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)。胰腺癌患者術(shù)前未行放療及化療。標(biāo)本一式兩份，一份立即置液氮冷凍，然后置-80℃保存。另一份經(jīng)10%甲醛固定后用石蠟包埋。40例患者中男性19例，女性11例；年齡39～75歲，平均57歲。

二、實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)TLR9 mRNA表達(dá)

參照Trizol試劑盒(Sigma公司)說(shuō)明書(shū)提取組織總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度和濃度。采用ReverTra Ace(Toyobo公司)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank人TLR9 mRNA序列，TLR9上游引物5′-GCCCAAATCCCTCATATCCC-3′，下游引物5′-AACAGTTGCCGTCCATGAATAG-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物113 bp；內(nèi)參β-actin上游引物5′-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3′，下游引物5′-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物190 bp。引物由上海生工技術(shù)服務(wù)有限公司合成。采用實(shí)時(shí)定量 PCR(SYBR GREEN)法檢測(cè)TLR9 mRNA。反應(yīng)程序：50℃ 2 min，95℃ 2 min，然后95℃ 15 s、50℃ 15 s， 72℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)。最后72℃延伸10 min。通過(guò)HONGSHI公司PCR儀自帶軟件獲得△Ct值，△Ct=Ct目的基因-Ctβ-actin。以10例正常胰腺組織的△Ct均值作為對(duì)照，△△Ct=△Ct癌或癌旁-△Ct對(duì)照，癌或癌旁組織的擴(kuò)增倍數(shù)為2-△△CT。

三、免疫組化法檢測(cè)TLR9蛋白表達(dá)

應(yīng)用免疫組織化學(xué)試劑盒(武漢博士德公司)，按說(shuō)明書(shū)操作。以已知TLR9陽(yáng)性的肺癌組織[3]作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。隨機(jī)觀(guān)察10個(gè)高倍視野，根據(jù)著色強(qiáng)度和著色細(xì)胞百分率進(jìn)行分析。著色程度：未著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；著色細(xì)胞陽(yáng)性率：<5%為0分，5%～<25%為1分， 25%～50%為2分，>50%為3分。將兩個(gè)分值相加，0～1分為-，2～3分為﹢，4～5分為﹢﹢，>5分為﹢﹢﹢?！?分為高表達(dá)，0～3分為低表達(dá)。

四、蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)TLR9蛋白表達(dá)

常規(guī)提取組織蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白濃度。取15 μl蛋白行蛋白質(zhì)印跡法。兔抗人TLR9單克隆抗體(Cell signaling公司)1∶750稀釋?zhuān)詈驟CL發(fā)光，X膠片曝光。采用自動(dòng)電泳凝膠成像分析軟件(Band scan v5.0)進(jìn)行圖像掃描和分析。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，應(yīng)用t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、 Fisher 精確概率法及秩和檢驗(yàn)行數(shù)值間的差異和相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、TLR9 mRNA的表達(dá)

正常胰腺組織、胰腺癌組織和癌旁胰腺組織中均有TLR9 mRNA表達(dá)。以正常胰腺組織TLR9 mRNA為對(duì)照，胰腺癌組織TLR9 mRNA的擴(kuò)增倍數(shù)為2.32(1.41～3.22),癌旁組織為1.23(1.18～1.28)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.642，P<0.05)。

二、TLR9蛋白的表達(dá)

TLR9主要表達(dá)于癌細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色或棕褐色，染色均一，癌旁組織及正常胰腺組織也可見(jiàn)TLR9表達(dá)，但呈淺黃色(圖1)。正常胰腺組織、胰腺癌旁組織和胰腺癌組織TLR9陽(yáng)性表達(dá)率分別為20.0%(2/10)、33.3%(10/30)和73.3%(22/30)，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.99，P值均<0.01)。30例胰腺癌組織的TLR9蛋白高表達(dá)與腫瘤部位以及腫瘤大小無(wú)關(guān)，而與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(表1)。

圖1TLR9蛋白在胰腺癌組織(a)、癌旁胰腺組織(b)及正常胰腺組織(c)中的表達(dá)(免疫組化 ×200)

正常胰腺組織、癌旁組織和胰腺癌組織的TLR9相對(duì)表達(dá)量分別為0.173±0.043、0.400±0.018、0.780±0.026，癌組織的表達(dá)較癌旁組織及正常胰腺組織均明顯增加(P值均<0.01,圖2)。

表1 胰腺癌組織TLR9表達(dá)與病理參數(shù)的關(guān)系

1：正常胰腺組織；2：癌旁胰腺組織；3：胰腺癌組織

討 論

1997年Medzhitov等[2]首次發(fā)現(xiàn)人類(lèi)第一種Toll同源變體TLR4后又發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)了10種人的TLR家族蛋白，分別命名為T(mén)LR1～TLR11。其中TLR9是TLR家族的重要成員，它特異性識(shí)別的PAMPS為細(xì)菌和病毒DNA中的CpG基序或人工合成的寡脫氧核苷酸(CpG-ODN)[3]，在介導(dǎo)外源CpG-DNA激活先天免疫過(guò)程中有重要的生物學(xué)意義。TLR9除抗感染作用外,還與自身免疫紊亂、惡性腫瘤的發(fā)生相關(guān)[4]。有研究表明，TLRs表達(dá)的上調(diào)與胃癌、腸癌、肺癌等發(fā)生、發(fā)展可能有密切關(guān)系[5]。同時(shí),TLR9在腫瘤的表達(dá)可為腫瘤的化療、免疫治療提供新方法。但目前對(duì)于TLR9在胰腺癌中的表達(dá)及作用了解甚少。

本研究結(jié)果顯示，胰腺癌組織TLR9 mRNA表達(dá)高于癌旁組織及正常胰腺，胰腺癌組織TLR9蛋白表達(dá)也顯著高于癌旁組織和正常胰腺，與Droemann等[6]在肺癌中的研究結(jié)果一致。胰腺癌組織TLR9的高表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤部位以及大小無(wú)關(guān)，而與腫瘤分化程度、TMN分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)距轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示TLR9不僅參與正常胰腺組織的生長(zhǎng)和發(fā)育等生理功能，也參與胰腺組織的惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程。

[1] Jurk M,Vollmer J.Therapeutic applications of synthetic CpG oligodeoxynucleotides as TLR9 agonists for immune modulation.Bio Drugs,2007,21:387-401.

[2] Medzhitov R,Preston-Hurlburt P,Janeway CA Jr.A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. Nature,1997,388:394-397.

[3] Hemmi H,Takeuchi O,Kawai T,et al.A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA.Nature,2000,408:740-745.

[4] Ishii KJ, Akira S. Innate immune recognition of, and regulation by, DNA. Trends Immunol，2006,27:525-532.

[5] Coussens LM,Werb Z.Inflammation and cancer.Nature,2002,420:860-867.

[6] Droemann D, Albrecht D, Gerdes J,et al. Human lung cancer cells express functionally active Toll-like receptor 9.Respir Res,2005,6:1-10.

2010-03-04)

(本文編輯：呂芳萍)

TLR9expressioninpancreaticcanceranditsclinicsignificance

WUHan-qing,WUHe-shui,ZHUShi-kai,ZHANGJian-jun,YANGZhi-yong,WANGChun-you.

PancreaticSurgeryCenter,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China

WUHe-shui,Email:heshuiwu@163.com

ObjectiveTo detect the expression of Toll-like receptor 9 (TLR9) in pancreatic cancer, and to explore its clinical significance.MethodsThe real-time PCR, Western blotting and immunohistochemistry were used to examine the expression of TLR9 in 30 samples of pancreatic cancer and the adjacent tissues, and 10 samples of normal pancreatic tissues. The relationships of TLR9 with clinicopathological parameters were analyzed.ResultsCompared with normal pancreatic tissues, the amplification value of TLR9 mRNA expression was 2.32 fold (1.41～3.22) in human pancreatic cancer, was 1.23 fold (1.18～1.28) in paracancerous tissues, respectively, and the difference was statistically significant (P<0.05). The percentage of positive cells expressing TLR9 protein in human pancreatic cancer tissues, paracancerous tissues and normal tissues were 73.3%(22/30), 33.3%(10/30) and 20.0%(2/10), and the relative expressions of TLR9 protein were 0.780±0.026,0.400±0.018,0.173±0.043,respectively, and the difference was statistically significant(P<0.05). The highly expressed TLR9 was positively correlated with the degree of tumor differentiation, TNM stage and lymph node metastasis.ConclusionsTLR9 was highly expressed in pancreatic cancer tissues. TLR9 expression plays a role in the canceration of pancreatic tissues.

Pancreatic neoplasms; Toll-like receptor 9; Expression; Pathology, clinical

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.02.003

國(guó)家自然科學(xué)基金(30200272)

430022 湖北武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院胰腺外科中心

吳河水，Email:heshuiwu@163.com