王曉燕 周永靜 龔丹丹 徐軍 徐岷 范鈺

·論著·

VEGF基因沉默對胰腺癌細胞化療敏感性和Akt信號通路的影響

王曉燕 周永靜 龔丹丹 徐軍 徐岷 范鈺

目的觀察靶向血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)基因小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)對胰腺癌BxPC3細胞化療藥物敏感性的影響，并探討其可能機制。方法將培養(yǎng)后的BxPC3細胞分為單純BxPC3細胞組、脂質(zhì)體處理組、錯配siRNA轉(zhuǎn)染組和VEGF siRNA轉(zhuǎn)染組。以5、10、20、100、200 nmol/L的VEGF siRNA轉(zhuǎn)染BxPC3細胞。采用實時定量RT-PCR和ELASA法檢測細胞VEGF mRNA 和蛋白的表達；MTT法檢測吉西他濱對各組細胞生長的影響；蛋白質(zhì)印跡法檢測BxPC3細胞Akt蛋白的磷酸化。結(jié)果VEGF siRNA轉(zhuǎn)染后，BxPC3細胞VEGF mRNA和蛋白呈濃度和時間依賴性明顯下調(diào)，但對BxPC3細胞的增殖無明顯影響。用0.2 μmol/L吉西他濱處理細胞48 h后，BxPC3細胞組、錯配siRNA組及5、10、20 nmol/L siRNA組細胞的生長抑制率分別為(16.9±0.3)%、(17.3±0.3)%、(28.8±0.4)%、(52.2±0.3)%、(75.4±0.4)%，抑制率與siRNA濃度相關(guān)(r=0.928)。同時， siRNA轉(zhuǎn)染后細胞Akt蛋白的磷酸化被明顯抑制。結(jié)論VEGF基因在胰腺癌BxPC3細胞耐藥中起著重要的作用，其機制可能與Akt蛋白磷酸化有關(guān)。

胰腺腫瘤； 血管內(nèi)皮生長因子； RNA,小分子干擾； 化療敏感性； Akt

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一個強有力的促血管生成因子，在與血管內(nèi)皮細胞增生相關(guān)的生理和病理過程中起重要作用，特別是與實體瘤的關(guān)系密切[1]。Takeda等[2]發(fā)現(xiàn)，VEGF高表達與癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。最近有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，VEGF在部分腫瘤耐藥中發(fā)揮著重要的作用[3]，但在胰腺癌中的研究較少。本研究應(yīng)用靶向VEGF的小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染胰腺癌BxPC3細胞，觀察其對化療敏感性的影響，并探討其可能的機制。

材料與方法

一、細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人胰腺癌細胞BxPC3由本院組織細胞生物庫凍存，解凍后常規(guī)培養(yǎng)。將對數(shù)生長期細胞以1.0×105個細胞接種于24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h。分為單純BxPC3細胞組、單純脂質(zhì)體處理組、錯配siRNA(Scr-siRNA)轉(zhuǎn)染組和靶向VEGF的siRNA轉(zhuǎn)染組。Scr-siRNA正義鏈序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTDTD-3′，轉(zhuǎn)染細胞濃度為200 nmol/L。VEGF siRNA的正義鏈序列為5′-GGAGUACCCUGAUGAGAUCDTDT-3′，轉(zhuǎn)染濃度為5、10、20、100、200 nmol/L。siRNA由美國Dharmacon公司合成。應(yīng)用OligofectamineTM2000(Santa Cruz公司)轉(zhuǎn)染細胞，按說明書操作。

二、實時定量RT-PCR檢測VEGF mRNA

收集轉(zhuǎn)染24、48、72 h后的各組細胞，Trozol抽提細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，PCR 擴增。VEGF上游序列5′-GCCTTGCCTTGCTGCTCTAC-3′，下游序列5′-TTCTGCCCTCCTCCTTCTGC-3′，擴增片段638 bp；FAM探針序列5′-CATGGGTGCCCCGACGTTGC-3′ TAMRA；以GAPDH為內(nèi)參。PCR反應(yīng)條件：50℃ 2 min,95℃ 10 min、95℃ 15 s、60℃ 1min，40個循環(huán)。mRNA表達量為2-ΔCt，其中△Ct=Ct轉(zhuǎn)染組-CtBxPC組。以BxPC3組細胞表達量為100%，計算其他各組的表達百分率。

三、ELASA法檢測VEGF蛋白

收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細胞，細胞計數(shù)后制備勻漿，采用ELISA試劑盒(R&D公司)檢測VEGF蛋白含量，操作步驟參照說明書進行。終止反應(yīng)后15 min內(nèi)用酶標儀測A450值。根據(jù)標準品濃度及對應(yīng)的A450值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣本的A450值計算出對應(yīng)的樣品濃度。

四、MTT法檢測胰腺癌細胞增殖

收集培養(yǎng)24、48、72 h后的各組細胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640調(diào)整細胞濃度，以每孔103個細胞接種于96孔板內(nèi)，應(yīng)用MTT法檢測細胞增殖。

五、胰腺癌細胞化療敏感性檢測

BxPC3細胞轉(zhuǎn)染48 h后，加入終濃度為0.2 μmol/L吉西他濱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl，培養(yǎng)4 h后去上清，加二甲基亞砜0.1 ml，用酶標儀測A570值。以不加吉西他濱作為對照組，每組5復(fù)孔?；熕幬飳毎L抑制率(IR)=(1-A570吉西他濱組)/A570對照組×100%。

六、Akt磷酸化蛋白(p-Akt)檢測

收集上述各組細胞，PBS洗滌后用PBS重懸，加入蛋白提取液，煮沸振蕩，離心取上清。蛋白定量后，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測p-Akt，以β-actin為內(nèi)參。

七、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、BxPC3細胞VEGF mRNA表達的變化

siRNA轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞后，VEGF mRNA表達呈濃度和時間依賴性明顯降低(P<0.001)；而BxPC3組、脂質(zhì)體組、Scr-siRNA組細胞VEGF mRNA的表達均無明顯變化。

二、BxPC3細胞VEGF蛋白表達的變化

BxPC3組、脂質(zhì)體組細胞VEGF蛋白表達量分別為(2689±27)pg/106cells、(2675±32)pg/10cells，兩組間無明顯差異；5、10、20 nmol/L siRNA轉(zhuǎn)染組細胞VEGF蛋白表達量分別為(1678±28)pg/106cells、(1236±22)pg/106cells、(828±39)pg/106cells，較BxPC3組呈濃度依賴性明顯下降(P<0.01)。

三、BxPC3細胞增殖的變化

siRNA轉(zhuǎn)染后BxPC3細胞的增殖無明顯變化(圖1)。

圖1 BxPC3組(a)和siRNA組(b)細胞的增殖(MTT法 ×100)

四、BxPC3細胞對化療藥物敏感性的變化

吉西他濱處理后，BxPC3組、錯配siRNA組細胞的增殖抑制率分別為(16.9±0.33)%、(17.3±0.3)，無顯著差別；5、10、20 nmol/L siRNA組細胞的增殖抑制率分別為(28.8±0.4)%、(52.2±0.3)%、(75.4±0.4)%，呈濃度依賴性細胞增殖(r=0.928)。吉西他濱對各濃度siRNA轉(zhuǎn)染的胰腺癌細胞生長均有明顯的抑制作用。

五、BxPC3細胞p-Akt表達的變化

siRNA呈濃度依賴性抑制Akt蛋白的磷酸化(圖2)。

圖2 siRNA各濃度組細胞p-Akt蛋白的表達

討 論

VEGF家族成員包括VEGF-A(即通常所指的VEGF)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盤生長因子(placenta growth factor，PIGF)。VEGF mRNA經(jīng)不同的剪切方式可得到7種不同的同功型，其氨基酸殘基數(shù)分別為121、145、148、165、183、189、206，最常見的是165個氨基酸，206個氨基酸較少見，并只在胎肝中發(fā)現(xiàn)。近年研究證明[4-5]，VEGF在組織器官的發(fā)生、正常狀態(tài)的維持、多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移中都發(fā)揮著重要作用。

本實驗結(jié)果顯示，靶向VEGF的siRNA轉(zhuǎn)染胰腺癌BxPC3細胞后，細胞VEGF mRNA和蛋白表達呈濃度和時間依賴性被抑制，表明siRNA轉(zhuǎn)染成功。

靶向VEGF的siRNA轉(zhuǎn)染后，對BxPC3細胞增殖無明顯影響，但能明顯地增強細胞對吉西他濱的化療敏感性，與Sun等[6]的報道結(jié)果類似。提示VEGF基因下調(diào)可增強化療藥物對VEGF高表達的癌細胞的化療敏感性。許多研究顯示[7-8]，Akt信號通路在許多癌細胞耐藥中發(fā)揮著重要的作用。Akt也稱蛋白激酶B(protein kinase B)，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，其激酶結(jié)構(gòu)域與蛋白激酶A和蛋白激酶C有70%的同源性。它可以被許多生長因子如血小板衍生生長因子、表皮生長因子和神經(jīng)生長因子等通過激活PI-3K (phosphoinositide 3- kinase)，活化PI-3K-PKB(Akt)信號通路。激活的Akt可以磷酸化胱冬蛋白酶-9(caspase-9)前體蛋白和Bad而使它們失活, 從而在保護細胞免于凋亡中起著重要作用[9]。本結(jié)果顯示，靶向VEGF的siRNA轉(zhuǎn)染可明顯抑制BxPC3細胞Akt蛋白磷酸化水平，且呈濃度依賴性，提示VEGF基因過表達在胰腺癌細胞化療耐藥性中起著重要的作用，其機制與Akt蛋白磷酸化有關(guān)。

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2010-08-09)

(本文編輯：呂芳萍)

EffectsofVEGFdownregulationbysmallinterferingRNAonchemosensitivityandAktsignalpathwayofhumanpancreaticcancercell

WANGXiao-yan,ZHOUYong-jing,GONGDan-dan,XUJun,XUMin,FANYu.

CancerInstitute,ZhenjiangMunicipalPeople′sHospital,JiangsuUniversity,Zhenjiang212002,China

FANYu,Email：yuf36@sina.com

ObjectiveTo study the effects VEGF small interfering RNA (siRNA) on chemosinsitivity of human BxPC3 cell and its mechanism.MethodsBxPC3 cells were divided into single BxPC3 cell group, lipofection group, scrambled siRNA transfection (200 nmol/L) group, VEGF siRNA transfection group. VEGF siRNA (5, 10, 20, 100, 200 nmol/L) was used to transfect BxPC3 cells. Expressions of VEGF mRNA and protein were determined by real-time PCR and ELISA assay, respectively. MTT was performed to examine the inhibitory effects of gemcitabine on BxPC3 cells of each group. The phosphorylated-Akt protein was evaluated by Western blotting.ResultsAfter VEGF siRNA transfection, the expression of VEGF mRNA and protein in BxPC3 cells was down-regulated in a dose-and time-dependent manner, but there was no effect on BxPC3 cells proliferation. After 0.2 μmol/L of gemcitabine treatment for 48 h, the inhibitory rates were (16.9±0.3)%, (17.3±0.3)%, (28.8±0.4)%, (52.2±0.3)%, (75.4±0.4)% in BxPC3 cell group, lipofection group, 5,10,20 nmol/L VEGF siRNA transfection group, and the inhibitory effects were correlated with siRNA concentration (r=0.928). The phosphorylated-Akt protein was reduced significantly in siRNA transfected cells.ConclusionsVEGF gene plays an important role in BxPC3 cells resistence to chemotherapy through inhibiting Akt phosphorylation.

Pancreatic neoplasms; Vascular endothelial growth factor; RNA, small interfering; Chemosensitivity; Akt

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.02.006

鎮(zhèn)江市社會發(fā)展基金(SH2009014)；鎮(zhèn)江市衛(wèi)生事業(yè)發(fā)展基金(WS0908)

212002 江蘇鎮(zhèn)江，江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院腫瘤研究所(王曉燕、周永靜、龔丹丹、徐軍、范鈺)；江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院消化科(徐岷)

范鈺，Email：yuf36@sina.com