袁偉燕 周國雄 黃華 許海玲 黃中偉

·論著·

重癥急性胰腺炎腦損傷時海馬神經(jīng)元凋亡與核轉(zhuǎn)錄因子-κB的關(guān)系

袁偉燕 周國雄 黃華 許海玲 黃中偉

目的探討急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠合并腦損傷時腦組織海馬神經(jīng)元凋亡及其與NF-κB p65之間的關(guān)系。方法64只SD大鼠按數(shù)字表法隨機分為生理鹽水(NS)組和ANP組。胰膽管逆行注入4%?；悄懰徕c制備ANP模型。尼氏染色法檢測腦組織海馬神經(jīng)元的損傷，TUNEL法檢測神經(jīng)元凋亡，RT-PCR法及免疫組化法檢測海馬組織NF-κB p65 mRNA 和蛋白的表達(dá)。結(jié)果ANP組大鼠海馬神經(jīng)元缺失，胞核固縮，核仁欠清晰，尼氏小體減少或消失，損傷隨時間延長逐漸加重。ANP組大鼠制模后3、6、12 h的神經(jīng)元凋亡指數(shù)分別為10.63±0.24、21.02±0.25、17.12±0.36，顯著高于NS組同時點的0.33±0.19、0.71±0.67、0.45±0.33(P值均<0.01)；NF-κB p65 mRNA表達(dá)量分別為0.63±0.05、1.05±0.06、0.92±0.05，顯著高于NS組同時點的0.11±0.01、0.12±0.01、0.08±0.01(P值均<0.05)。NF-κB p65蛋白的變化與其mRNA的變化一致。結(jié)論ANP大鼠腦損傷的早、中期與神經(jīng)元凋亡關(guān)系密切，其機制可能與NF-κB p65的激活有關(guān)。

胰腺炎，急性壞死性； 腦損傷； 神經(jīng)元； 細(xì)胞凋亡； 核轉(zhuǎn)錄因子-κB

重癥急性胰腺炎(SAP)是消化內(nèi)科常見急重癥之一，常常并發(fā)多臟器功能不全，腦損傷也是常見的并發(fā)癥之一。胰性腦病病情兇險，目前尚無有效的診療方法，對其發(fā)病機制亦未能完全了解。本實驗檢測急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠合并腦損傷時腦組織海馬神經(jīng)元的凋亡及NF-κB p65的表達(dá)，分析它們之間的關(guān)系。

材料與方法

一、實驗動物分組及模型制備

健康雄性清潔級SD大鼠64只，體重260～300 g，由南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。按數(shù)字表法隨機分為生理鹽水(NS)組和ANP組，每組32只。膽胰管內(nèi)逆行注入4%牛磺膽酸鈉(Sigma公司)0.1 ml/100 g體重的方法制備ANP模型，NS組逆行注入等量的無菌生理鹽水。制模后0、3、6、12 h分批處死8只大鼠，取血液、胰腺及海馬組織。胰腺組織置4%多聚甲醛固定；大腦海馬組織部分置4%多聚甲醛固定，部分立刻置液氮冷凍，-80℃冰箱保存。

二、血清淀粉酶測定

采用酶法，由美國Vitros-250型全自動生化分析儀測定。

三、胰腺組織病理學(xué)檢查及評分

固定的胰頭部組織常規(guī)切片，HE染色，由病理科醫(yī)師閱片，按Rongione等[1]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理評分。

四、海馬尼氏染色

固定的海馬組織常規(guī)石蠟包埋、切片，置室溫30 min，蒸餾水沖洗后放入預(yù)熱50℃的1%甲苯胺藍(lán)水溶液中，置56℃溫箱染色20 min，沖洗后乙醇分化、脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察神經(jīng)元。細(xì)胞核呈淡藍(lán)色，尼氏小體呈深藍(lán)色。

五、海馬神經(jīng)元凋亡指數(shù)測定

采用TUNEL法，按TUNEL試劑盒(德國MERCK公司)說明書操作。使用Image Pro Plus 5.1圖像分析軟件分析結(jié)果，凋亡指數(shù)(AI)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

六、海馬組織NF-κB p65蛋白檢測

采用免疫組化SP法。抗NF-κB p65一抗(Santa Cruz公司)工作濃度為1∶100，以PBS代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判定：錐體細(xì)胞的胞核及胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。

七、海馬組織NF-κB p65 mRNA檢測

為保證鋼纖維混凝土施工質(zhì)量，必須結(jié)合工程實際進(jìn)行鋼纖維混凝土配合比設(shè)計和幾何參數(shù)的確定，鋼纖維增強效果與長度、等效直徑和長徑比等參數(shù)有關(guān)，隨長徑比的增大鋼纖維增強作用隨之增加，長度太短起不到增強作用，太長則會增加施工難度，長徑比過大將影響拌和物質(zhì)量，過小則容易在拌和過程中折彎。鋼纖維材料必須與基材相適應(yīng)，抗拉強度保持在至少500MPa，鋼纖維混凝土設(shè)計過程中重點考慮鋼纖維的等效直徑和長徑比，如表1所示，本工程鋼纖維等效直徑控制在0.55mm以上。

以Trizol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取2 μl cDNA行PCR擴增。NF-κB p65上游引物5′-GACCTGGAGCAAGCCATTAG-3′，下游引物5′-ATCAGAAGGCCGCCGAAGC-3′，擴增片段459 bp；內(nèi)參GAPDH上游引物5′-TGATGACATCAAGAA-GGTGGTGAAG-3′，下游引物5′-TCCTTGGAGGCC-ATGTGGGCCAT-3′，擴增片段240 bp。PCR反應(yīng)條件：94℃ 4 min，94℃ 40 s、58℃ 40 s、72℃ 45 s, 35個循環(huán)，最后72℃ 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)掃描，以NF-κB p65與GAPDH灰度比值表示NF-κB p65 mRNA相對表達(dá)量。

八、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、血清淀粉酶含量

制模后0、3、6、12 h NS組血清淀粉酶含量分別為(1954±112)U/L、(3390±226)U/L、(2362±261)U/L、(2073±155)U/L；ANP組分別為(2684±126)U/L、(7758±270)U/L、(11648±858)U/L、(9851±238)U/L。ANP組各時間點的血清淀粉酶含量均顯著高于NS組(P值均 <0.05)。

二、胰腺組織病理學(xué)變化

NS組大鼠胰腺無明顯損傷，制模后0、3、6、12 h的病理分值分別為0.41±0.16、0.51±0.31、0.58±0.33、0.68±0.12；ANP組6 h后見大量炎性細(xì)胞浸潤，片狀出血，胰腺小葉結(jié)構(gòu)破壞，大量腺泡細(xì)胞壞死(圖1)，制模后0、3、6、12 h的病理分值分別為2.15±0.35、3.49±0.85、4.28±0.52、6.39±1.71，均顯著高于同時間點的NS組(P值均 <0.05)。

三、海馬神經(jīng)元的變化

NS組海馬區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊致密，核大而圓，核仁明顯，尼氏小體豐富。ANP組可見錐體細(xì)胞缺失，殘留細(xì)胞排列不規(guī)則，胞核固縮，核仁欠清晰，尼氏小體減少或消失，海馬神經(jīng)元損傷隨時間延長逐漸加重(圖2)。

圖1ANP組6 h的胰腺病理改變(HE ×125)圖2ANP組12 h海馬的神經(jīng)元改變(尼氏染色 ×200)

四、海馬神經(jīng)元的凋亡

NS組偶可見凋亡細(xì)胞(圖3a)。ANP組0 h有少量凋亡細(xì)胞，6 h凋亡細(xì)胞最多(圖3b)。制模后0、3、6、12 h NS組AI分別為0.22±0.13、0.33±0.19、0.71±0.67、0.45±0.33；ANP組AI分別為4.28±0.14、10.63±0.24、21.02±0.25、17.12±0.36，較NS組顯著增加(P值均<0.01)。

圖3NS組(a)和ANP組(b)6 h時海馬的凋亡神經(jīng)元(TUNEL ×200)

五、海馬組織NF-κB p65蛋白表達(dá)

NS組偶見少量錐體細(xì)胞有NF-κB p65蛋白表達(dá)，主要位于胞質(zhì)(圖4a)，且表達(dá)較弱。ANP組錐體細(xì)胞NF-κB p65蛋白表達(dá)增加，主要位于胞核(圖4b)，于6 h達(dá)高峰。

圖4NS組(a)和ANP組(b)6 h時海馬組織NF-κB蛋白表達(dá)(免疫組化 ×100)

六、海馬組織NF-κB p65 mRNA表達(dá)

NS組海馬組織NF-κBp65 mRNA表達(dá)極弱，制模后0、3、6、12 h的表達(dá)量分別為0.10±0.03、0.11±0.01、0.12±0.01、0.08±0.01。ANP組海馬組織NF-κB p65 mRNA表達(dá)增加，6 h達(dá)高峰(圖5)，制模后0、3、6、12 h的NF-κB p65 mRNA表達(dá)量分別為0.24±0.04、0.63±0.05、1.05±0.06、0.92±0.05，較NS組各時間點顯著增強(P值均<0.05)。

M：標(biāo)準(zhǔn)參照物；1、2、3、4分別為ANP組 0、3、6、12 h點；5：NS組 6 h點

圖5海馬組織NF-κB p65 mRNA 的表達(dá)

討 論

Menza等[2]研究認(rèn)為，胰性腦病的發(fā)生與胰酶對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷有關(guān)。趙海平等[3]研究認(rèn)為，實驗性ANP并腦損傷的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等有關(guān)。

NF-κB在機體的免疫、炎癥反應(yīng)及凋亡調(diào)控等方面發(fā)揮著重要作用[4]，它能刺激IL-1β轉(zhuǎn)化酶蛋白、c-myc、TNF-α、CED基因的表達(dá)[5]。NF-κB在腦組織內(nèi)的活性相對高于其他組織[6]，在神經(jīng)系統(tǒng)炎癥、缺血、損傷等疾病中均存在NF-κB的激活[7]。

本實驗結(jié)果顯示，ANP組隨時間延長海馬神經(jīng)元損傷逐漸加重，細(xì)胞凋亡顯著增加，NF-κB p65表達(dá)顯著增強，并均于6 h達(dá)高峰，12 h時略有減少，表明NF-κB p65在牛磺膽酸鈉誘導(dǎo)的ANP并腦損傷的發(fā)生、發(fā)展過程中通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡來加重神經(jīng)元損傷。NF-κB p65在ANP并腦損傷的早、中期作用較晚期明顯，提示晚期腦損傷除了與NF-κB激活及細(xì)胞凋亡有關(guān)外，還可能有其他一些因素的參與。

[1] Rongione AJ, Kusske AM, Ashley SW, et al. Interleukin 10 reduces the severity of acute pancreatitis in rats.Gastroenterology,1997,112:960-967.

[2] Menza MA，Murraay GB.Pancreatic encephalopathy.Biol Psychiatry，1989，25：781-784.

[3] 趙海平，呂飛飛，歐陽曉暉.丙二醛、超氧化物歧化酶及腫瘤壞死因子-α在大鼠實驗性胰性腦病中的作用.中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志.2008,15:337-341.

[4] 劉玲.NF-κB的活化與神經(jīng)細(xì)胞凋亡.國外醫(yī)學(xué),2003,23:621-623.

[5] 陶陸陽，丁梅. 大鼠腦挫傷后NF-kB表達(dá)的分子生物學(xué)研究. 法醫(yī)學(xué)雜志.2004,5:73-80.

[6] O′Neill LA,Kaltschmidt C.NF-kappa B:a crucial transcription factor for glial and neuronal cell function.Trends Neurosci,1997,20: 252-258.

[7] Zhu Y,Culmsee C,Klumpp S,et al.Neuroprotection by transforming growth factor-beta 1 involves activation of nuclear factor-kappaB through phosphatidylinositol-3-OH kinase/Akt and mitogen activated protein kinase-extracellular signal tegulated kinase 1,2 signaling pathways.Neuroscience,2004,123:897-906.

2010-09-13)

(本文編輯：屠振興)

HippocampalneuronalapoptosisandnuclearfactorκBexpressioninratswithacutenecrotizingpancreatitiswithbraininjury

YUANWei-yan,ZHOUGuo-xiong,HUANGHua,XUHai-ling,HUANGZhong-wei.

DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospital,NantongUniversity,Nantong226001,China

HUANGZhong-Wei,Email：yuanweiyan77@tom.com

ObjectiveTo investigate the relationship between expression of nuclear factor kappa B p65 (NF-κB p65) and hippocampal neuronal apoptosis in acute necrotizing pancreatitis (ANP) rats with brain injury.MethodsSixty-four SD rats were randomized into normal saline group (NS) and ANP group. The ANP rat model was induced by retrograde injection of 4% sodium taurocholate into the pancreaticobiliary duct of SD rats. Nissle stain was used to detect the brain injury. Neuronal apoptosis was determined by TUNEL. NF-κB p65 expression was detected by immunohistochemistry and RT-PCR.ResultsHippocampal neuron was absent, karyopyknosis, unclear nucleolus and decreased Nissl bodies were found, the injuries was aggravated with time. The apoptosis index at the 3, 6 and 12 h in ANP group was 10.63±0.24, 21.02±0.25, 17.12±0.36,respectively, while they were 0.33±0.19, 0.71±0.67, 0.45±0.33 in NS group, and the difference was statistically significant (P<0.01). The expressions of NF-κB p65 mRNA were 0.63±0.05,1.05±0.06,0.92±0.05, which were significantly higher than those in the NS group (0.11±0.01,0.12±0.01,0.08±0.01,P<0.05). The change of expression of NF-κB p65 protein was consistent with that of NF-κB p65 mRNA.ConclusionsThe brain injury of ANP rats was highly correlated with neuronal apoptosis at the early and middle phase of ANP, and its mechanism may be related with NF-κB p65 activation.

Pancreatitis,acute necrotizing; Brain injury; Neurons; Apoptosis; Nuclear factor-κB

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.02.014

226001 江蘇南通，南通大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科

黃中偉，Email:yuanweiyan77@tom.com