文吉秋 陳勁松 季曙明 陳惠萍 孫啟全 程東瑞 劉志紅

腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)仍然是影響移植腎預(yù)后的一個重要因素。Sarwal等［1］首次提出腎移植急性排斥反應(yīng)組織中CD20+細胞浸潤是判斷移植腎急性排斥反應(yīng)預(yù)后不良的重要因素。隨后很多研究證實了這個觀點［2－4］，近期研究發(fā)現(xiàn)CD38+B淋巴細胞聯(lián)合CD20+細胞是移植腎預(yù)后較差的指標［5］，抗CD20單克隆抗體可以有效治療移植腎難治性排斥反應(yīng)，并取得了較好效果［6，7］。然而也有學(xué)者認為移植腎急性排斥反應(yīng)中CD20淋巴細胞聚集與移植腎預(yù)后無相關(guān)性［8－10］。迄今為止，CD20淋巴細胞聚集與移植腎預(yù)后的關(guān)系還存在爭議。

既往研究顯示，移植腎急性排斥反應(yīng)中CD20+細胞浸潤是預(yù)后不良的標志，同時發(fā)現(xiàn)CD20+細胞聚集較多的患者急性排斥反應(yīng)發(fā)生時間晚于CD20+細胞聚集較少者［11］，這與此后的研究結(jié)論相一致［12］。本研究回顧性分析了不同時期急性細胞性排斥反應(yīng)中各種不同類型浸潤細胞的分布特點，特別關(guān)注在不同時期發(fā)生的急性細胞性排斥反應(yīng)中CD20+細胞聚集與移植腎預(yù)后之間的關(guān)系。

對象和方法

研究對象 2003年5月～2008年12月在南京軍區(qū)南京總醫(yī)院全軍腎臟病研究所行同種異體腎移植并經(jīng)移植腎活檢診斷急性細胞性排斥反應(yīng)患者55例(符合Banff 97標準IA，IB和ⅡA級)，腎組織C4d免疫熒光染色均為陰性［13］。入選患者根據(jù)排斥反應(yīng)和腎活檢時間分為3組［14］:極早期排斥反應(yīng)組17例(極早期組，＜2周)，早期排斥反應(yīng)組16例(早期組，2周～6月)和晚期排斥反應(yīng)組22例(晚期組，＞6月)。

治療和隨訪 患者均接受抗CD25單克隆抗體誘導(dǎo)治療(賽尼哌或舒萊)，維持性免疫抑制劑方案包括神經(jīng)鈣蛋白抑制劑(他克莫司或者環(huán)孢素)，抗增生藥物(霉酚酸酯或咪唑立賓)和潑尼松。在診斷為急性細胞排斥反應(yīng)后均接受積極的免疫抑制治療，首先予甲潑尼龍500mg沖擊治療3d，之后潑尼松逐漸減至維持劑量。甲潑尼龍沖擊治療后3d內(nèi)血清肌酐(SCr)無下降者定義為激素耐藥［2］，加用免疫吸附等強化治療?；颊唠S訪中位期為48月。

腎活檢 移植腎活檢在B超引導(dǎo)下實行實時穿刺，穿刺針為18G，采用負壓吸引穿刺法，取得腎組織符合Banff規(guī)定的要求［13］。

光鏡 用石蠟切片行HE、PAS和PASM染色，并在尼康8100顯微鏡下觀察。其中腎小球炎、間質(zhì)細胞浸潤、動脈內(nèi)膜炎、腎小管炎采等反應(yīng)急性排斥反應(yīng)的指標采用Banff 97方法進行積分。

免疫熒光 應(yīng)用冰凍組織切片行 IgA，IgG，IgM，C3，C4和 C4d染色。

免疫組織化學(xué) 應(yīng)用石蠟切片免疫組織化學(xué)Envision兩步法:石蠟切片脫蠟至水，用3%過氧化氫抑制內(nèi)源性過氧化物酶后，用1 ml EDTA溶液經(jīng)高壓鍋修復(fù)抗原，用正常10%小牛血清封閉，經(jīng)洗滌后分別加入單克隆鼠抗人CD20抗體(1∶100)和HLA-DR 抗體(1∶50)，CD68(1∶100)，CD4(1∶100)，CD8(1∶100)室溫孵育2h后，再加入Envision室溫孵育40 min，DAB 顯色5 min，蘇木素復(fù)染2 mins，烘干，中性樹膠封片。尼康8100顯微鏡下觀察［15］。HLA-DR判斷標準是計算陽性表達小管的百分比，用百分數(shù)來表示［15］。

細胞密度計算方法 由不知情臨床資料的病理醫(yī)生讀片，隨機選取16個高倍視野，計算每個視野內(nèi)的細胞數(shù)，總和為細胞密度(個/mm2)。根據(jù)細胞密度的中位數(shù)來判定高密度和低密度組。

觀察內(nèi)容 首先比較各組之間臨床資料和CD20+，CD4，CD8，CD68 細胞密度以及 HLA-DR 表達的差別，以及不同時期排斥反應(yīng)臨床特征和各種細胞密度分布特點。然后對所有入選患者根據(jù)CD20+細胞密度分為高密度組和低密度組，比較兩組之間CD68，CD4，CD8細胞密度以及HLA-DR表達的差別和移植腎存活率有無差別。再對兩周后發(fā)生的急性細胞性排斥反應(yīng)受者根據(jù)CD20+細胞密度分為高密度組和低密度組，比較兩組之間的移植腎存活率。

統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有計數(shù)資料用均數(shù)±標準差表示，三組之間率的差別應(yīng)用Fisher’s精確概率計算，兩組間一致性比較應(yīng)用方差分析。生存分析運用Kaplan-Meier生存分析法和Log-Rank方法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一般情況 三組患者性別比、供者類型，術(shù)前群體反應(yīng)性抗體水平、SCr、冷熱缺血時間和Banff病理分級之間差別無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)，但極早期組耐激素比例和移植腎丟失率均低于早期和晚期組。

表1 不同時期急性排斥反應(yīng)患者的臨床特征

不同時期急性排斥反應(yīng)組織浸潤細胞的差別極早期CD20+細胞密度低于早期組和晚期組，而CD4，CD8，CD68密度和腎小管 HLA-DR表達在三組之間無明顯差別。進一步計算發(fā)現(xiàn)，極早期組(CD4+CD8)/CD20比值明顯高于早期和晚期排斥反應(yīng)組(表2)。

表2 不同時間急性排斥反應(yīng)組浸潤細胞和小管HLA-DR表達的差別

CD20+細胞密度與移植腎預(yù)后的關(guān)系 所有入選患者按CD20+細胞密度中位數(shù)(168個/mm2)分為高密度組和低密度組。高密度組激素耐藥的比例高于低密度組(12/28 vs 4/27，P＜0.05)，Kaplan-Meier生存分析法顯示，CD20+細胞高密度組生存率低于低密度組(P＜0.05)(圖1)。

為排除其他因素對預(yù)后判斷的影響，對比CD20+細胞高密度組和低密度組的其他病理特點發(fā)現(xiàn)，腎小球炎、間質(zhì)細胞浸潤和動脈內(nèi)膜炎無明顯差別，其他浸潤細胞(CD4、CD8、CD68)和腎小管HLA-DR表達亦無明顯差別(表3)。CD20+細胞高密度組腎小管炎程度高于低密度組(P＜0.05)，而腎小管炎發(fā)生率無明顯差別(均為100%)。進一步對比發(fā)現(xiàn)，在CD20+細胞低密度組兩周內(nèi)急性排斥反應(yīng)比例明顯偏高(14/27 vs 2/18 P＜0.05)。

圖1 CD20+細胞高密度組和低密度組生存率分析

表3 CD20+細胞低密度組和高密度組病理特點

2周以后急性細胞性排斥反應(yīng)組CD20+細胞密度與移植腎預(yù)后的關(guān)系 考慮到極早期急性排斥反應(yīng)預(yù)后好(表1)，而在此期內(nèi)發(fā)生的急性排斥反應(yīng)CD20+細胞浸潤較少(表2)。為避免排斥反應(yīng)發(fā)生時間干擾CD20+細胞密度與移植腎生存率的關(guān)系，對腎移植術(shù)兩周后發(fā)生急性排斥的患者，依據(jù)該組CD20+細胞密度的中位數(shù)(≥224/mm2)分為CD20+細胞高密度組和低密度組，兩組之間耐激素比例無差別(8/19 vs6/19，P＞0.05)，移植腎生存率也無明顯差別(P＞0.05)(圖2)。

圖2 兩周后發(fā)生的急性細胞性排斥反應(yīng)不同CD20+細胞組移植腎生存率

討 論

CD20+細胞浸潤和排斥反應(yīng)發(fā)生時間的關(guān)系我們既往研究證實CD20+細胞聚集是移植腎預(yù)后不良的指標［11］，與 Sarwal最初的結(jié)論一致［1］，但又不同于后續(xù)有關(guān) CD20+細胞浸潤和預(yù)后的報道［8－10］。這些研究結(jié)果之所以存在差別，筆者認為主要與CD20+細胞浸潤程度的判斷標準、入選病例排斥反應(yīng)發(fā)生的時間及隨訪時間等因素有關(guān)，這些因素的變異導(dǎo)致了結(jié)果的不確定性。本研究觀察了CD20+細胞在不同時期細胞性排斥反應(yīng)中的分布特點，并進一步證實在移植腎急性排斥反應(yīng)中CD20+細胞浸潤和預(yù)后的關(guān)系。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，CD20+細胞高密度組急性排斥反應(yīng)發(fā)生時間較晚［(145.4±121.2)d vs(75.4 ±108.8)d，P ＞0.05］［11］，提示 CD20+細胞浸潤可能與移植腎急性排斥反應(yīng)發(fā)生時間有關(guān)，在移植后兩周內(nèi)發(fā)生急性細胞性排斥反應(yīng)者少有CD20+細胞聚集，而以其他單個核細胞浸潤為主(如CD4、CD8和CD68等)(表2)。但兩周后發(fā)生的急性排斥反應(yīng)中，部分患者已有CD20+細胞聚集，在超過6月的排斥反應(yīng)中，CD20+細胞浸潤聚集發(fā)生率更高。而CD4、CD8和CD68細胞浸潤程度和排斥反應(yīng)發(fā)生的時間無此規(guī)律。

CD20+細胞浸潤和移植腎預(yù)后的關(guān)系 在Sarwal最初的研究中采用定量法來計算CD20+細胞浸潤密度［1］，分為高密度組(＞250個/mm2)和低密度組(＜100個/mm2)。本研究是參照Sarwal最初提出的定量計算法來計算CD20+細胞密度，與之不同的是將所有患者根據(jù)CD20+細胞密度中位數(shù)分為高密度和低密度組。因此相對于所有急性排斥反應(yīng)患者，CD20+細胞密度中位數(shù)為168個/mm2。而腎移植術(shù)后兩周以后的急性排斥患者，CD20+細胞密度的中位數(shù)為224個/mm2。此舉的目的是為了對比不同時期細胞密度的差別。我們采用的定量法與其他學(xué)者提出的半定量計數(shù)法也具有良好的一致性［13］。因此我們認為此法具有科學(xué)性和可重復(fù)性，尤其是病理醫(yī)生對于臨床資料的雙盲更加保證了結(jié)果的準確性。

根據(jù)CD20+細胞浸潤密度中位數(shù)將入選患者分為高密度組和低密度組結(jié)果顯示，兩組間近期和遠期預(yù)后均較差，其中高密度組耐激素的比例高于低密度組，高密度組生存率低于低密度組這個結(jié)論與以前的某些研究結(jié)果相一致［2－4］。而對兩周后發(fā)生的急性細胞性排斥反應(yīng)進行分析發(fā)現(xiàn)，CD20+細胞高密度組和低密度組之間耐激素比例和移植腎生存率也無明顯差別，這個結(jié)論與既往某些研究有存在一致性［9，10］。

之所以出現(xiàn)上述不同結(jié)果，其可能原因在于極早期急性排斥組預(yù)后相對較好，而兩周后發(fā)生的排斥反應(yīng)近期和遠期預(yù)后均相對較差(表1)，這與以往文獻報道一致［15－18］。而本研究發(fā)現(xiàn)在極早期發(fā)生的急性細胞性排斥反應(yīng)中很少有CD20+細胞，因此極早期排斥反應(yīng)受者大部分為CD20+細胞低密度組。對所有排斥反應(yīng)進行分析時，低密度患者中納入了大部分極早期患者，而這部分患者預(yù)后較好導(dǎo)致低密度組預(yù)后較好。進一步分析發(fā)現(xiàn)高密度組和低密度組之間 CD4，CD8，CD68細胞密度，HLADR表達，細胞浸潤程度，腎小球炎及動脈內(nèi)膜炎均無差別，但是腎小管炎在CD20+細胞高密度組較為明顯，但是發(fā)生率無明顯差別(表3)。由以上資料得出，單純CD20+細胞密度不是判斷移植腎預(yù)后的指標，而是與發(fā)生排斥反應(yīng)的時間有很大聯(lián)系，這也恰好解釋了先前不同研究結(jié)論之間的差異。

其他表型B淋巴細胞和急性排斥反應(yīng)預(yù)后之間的關(guān)系 CD20+細胞在移植腎中浸潤與抗體產(chǎn)生無關(guān)［15］。Zarkhin等［12］研究認為 CD20+細胞在移植腎排斥反應(yīng)中可能參與抗原遞呈作用，與抗體產(chǎn)生無關(guān)，而 CD20+細胞進一步分化為 CD38+和CD138+陽性B淋巴細胞可能與抗體產(chǎn)生有關(guān)，但是此結(jié)論需要進一步證實，極早期發(fā)生的急性排斥反應(yīng)無需CD20+細胞參與，在兩周后發(fā)生急性排斥中CD20+細胞參與抗原遞呈，而晚期CD20+細胞轉(zhuǎn)化為CD38+和CD138+陽性B淋巴細胞，參與體液性排斥反應(yīng)，該假說需要進一步證實。

但是，目前的研究結(jié)論認為CD20+細胞在移植腎中浸潤與抗體產(chǎn)生無關(guān)是基于現(xiàn)有經(jīng)典的體液性排斥反應(yīng)標準，而新近的研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)典體液性排斥反應(yīng)標準存在敏感性低而特異性高的缺點，認為C4d在管周毛細血管的沉積診斷體液性排斥反應(yīng)可能是敏感性低而特異性高，可能會漏診某些病例，并提出了診斷體液性排斥反應(yīng)的新標準［19，20］，但尚未得到認同，需要進一步研究來證實。

小結(jié):在兩周內(nèi)發(fā)生的急性排斥反應(yīng)中有多種單個核細胞浸潤，但少有CD20+細胞聚集，兩周后發(fā)生的急性細胞性排斥反應(yīng)中，CD20+細胞浸潤程度與預(yù)后無關(guān)。而整體急性細胞性排斥反應(yīng)中，CD20+細胞低密度組的患者預(yù)后較好，可能與低密度組中極早期排斥反應(yīng)比例較高有關(guān)。

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