吳 偉 林親錄 華欲飛

脂質(zhì)氫過氧化物氧化修飾對大豆蛋白去折疊和復(fù)折疊性質(zhì)的影響

吳 偉1，2林親錄1，2華欲飛3

(中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，長沙 410004)
(糧油深加工與品質(zhì)控制湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，長沙 410004)
(江南大學(xué)食品學(xué)院3，無錫 214122)

以13－氫過氧化－順－9，反－11－十八碳二烯酸(HPODE)代表脂質(zhì)氫過氧化物，采用園二色譜和內(nèi)源熒光光譜研究不同濃度HPODE氧化修飾對大豆蛋白去折疊和復(fù)折疊性質(zhì)的影響。結(jié)果表明:復(fù)折疊過程中氧化大豆蛋白結(jié)構(gòu)恢復(fù)程度隨著大豆蛋白氧化程度的增加而下降;隨著蛋白質(zhì)氧化程度的增加，氧化大豆蛋白ΔGH2O、m以及去折疊分?jǐn)?shù)為50%對應(yīng)的尿素濃度(［Urea］1/2)逐漸下降，表明蛋白質(zhì)氧化導(dǎo)致大豆蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降;蛋白質(zhì)氧化還使得大豆蛋白去折疊速率增加，復(fù)折疊速率下降。

大豆蛋白 氧化修飾 去折疊 復(fù)折疊

蛋白質(zhì)氧化是蛋白質(zhì)分子在活性氧直接作用下，或通過次生氧化產(chǎn)物間接作用于蛋白質(zhì)而導(dǎo)致的蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)構(gòu)修飾［1］。大豆中富含脂肪氧合酶(LOX)和多不飽和脂肪酸(PUFA)，在大豆加工過程中，LOX－PUFA氧化體系通過自由基攻擊和活性氧化產(chǎn)物共價(jià)交聯(lián)導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化［1］。脂質(zhì)自由基和活性氧化產(chǎn)物誘導(dǎo)大豆蛋白氧化的研究已在前期報(bào)道，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氧化修飾改變大豆蛋白的去折疊和聚集性質(zhì)［2－5］，而去折疊和聚集反應(yīng)是大豆蛋白形成凝膠的重要步驟，因此氧化修飾也是影響大豆蛋白凝膠性質(zhì)的因素之一。

氧化修飾對蛋白質(zhì)凝膠性質(zhì)的影響機(jī)理目前還不甚清楚。一方面由于蛋白質(zhì)氧化應(yīng)急環(huán)境較復(fù)雜。LOX－PUFA氧化體系包括自由基、脂質(zhì)初級氧化產(chǎn)物和活性醛，目前蛋白質(zhì)氧化研究主要圍繞脂質(zhì)自由基和活性醛來進(jìn)行，而忽略了同樣具有氧化活性但結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的脂質(zhì)氫過氧化物，但研究發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)氫過氧化物在一定條件下穩(wěn)定性較好［6］。因此為了全面研究氧化修飾對大豆蛋白凝膠性質(zhì)的影響，需要研究脂質(zhì)氫過氧化物影響大豆蛋白凝膠性質(zhì)的機(jī)理。另一方面蛋白質(zhì)凝膠機(jī)理復(fù)雜。蛋白質(zhì)凝膠主要包括變性去折疊、聚集和形成凝膠網(wǎng)絡(luò)等步驟，變性去折疊是形成聚集體和凝膠網(wǎng)絡(luò)的前提條件，目前尚無氧化修飾對蛋白質(zhì)變性去折疊方面的報(bào)道，因此為了研究氧化修飾影響大豆蛋白凝膠性質(zhì)的機(jī)理，首先需要研究氧化修飾對大豆蛋白去折疊性質(zhì)的影響。

大部分蛋白質(zhì)熱變性是一個不可逆過程，蛋白質(zhì)熱變性過程中形成的聚集體影響蛋白質(zhì)去折疊性質(zhì)的研究。而尿素變性蛋白質(zhì)在一定條件下是一個可逆反應(yīng)［7］，在控制條件下尿素變性環(huán)境中可研究蛋白質(zhì)的去折疊和復(fù)折疊性質(zhì)。亞油酸是大豆中含量最豐富的PUFA，并且LOX催化亞油酸的主要產(chǎn)物是13－氫過氧化－順－9，反－11－十八碳二烯酸(HPODE)。因此本試驗(yàn)以HPODE代表脂質(zhì)氫過氧化物研究其對大豆蛋白在尿素中去折疊和復(fù)折疊性質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1．1 原料與試劑

LOX I－B和亞油酸:美國Sigma公司;其他試劑均為分析純。

1．2 主要儀器和設(shè)備

CR21G高速冷凍離心機(jī):日本日立公司;HH－S數(shù)顯恒溫水浴鍋:江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠;MOS－450圓二色譜儀:法國Bio－Logic公司;F96熒光分光光度計(jì):上海棱光技術(shù)有限公司。

1．3 試驗(yàn)方法

1．3．1 HPODE氧化大豆蛋白的制備

采用Hidalgo等［8］的方法在有氧條件下LOX催化亞油酸制備HPODE，然后采用前期研究的方法［5］制備HPODE氧化大豆蛋白，HPODE終濃度分別為0，0．001，0．01，0．1，1 和 10 mmol/L。

1．3．2 大豆蛋白去折疊樣品的制備

將大豆蛋白溶解于0．01 mol/L pH 7．0的磷酸鹽緩沖液中配制成5 mg/mL和0．5 mg/mL溶液備用。取1 mL蛋白液與一定體積的10 mol/L尿素溶液(溶于0．01 mol/L pH 7．0的磷酸鹽緩沖液)以及一定體積的0．01 mol/L pH 7．0的磷酸鹽緩沖液混合均勻，使得混合液總體積為5 mL并且尿素濃度從0 mol/L漸增到8 mol/L，此時(shí)混合液蛋白濃度分別為1 mg/mL和0．1 mg/mL，樣品在25℃水浴中放置12 h備用。

1．3．3 大豆蛋白復(fù)折疊樣品的制備

將4倍體積的10 mol/L尿素溶液(溶于0．01 mol/L p H 7．0的磷酸鹽緩沖液)與1倍體積的由1．3．2制備的蛋白質(zhì)溶液快速混合均勻，隨后25℃水浴放置12 h，取出0．5 mL混合液與一定體積的 10 mol/L 尿素(溶于 0．01 mol/L pH 7．0 的磷酸鹽緩沖液)以及0．01 mol/L pH 7．0的磷酸鹽緩沖液混合均勻，使得尿素濃度從8 mol/L逐漸稀釋至0．8 mol/L，并且在尿素稀釋倍數(shù)不同的情況下保持稀釋液總體積均為5 mL，此時(shí)蛋白濃度分別為1 mg/mL和0．1 mg/mL，隨后再次25℃水浴放置12 h。

采用分光光度計(jì)檢測大豆蛋白在去折疊和復(fù)折疊過程中220～340 nm之間吸光度的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)吸光度無顯著變化，說明大豆蛋白在去折疊和復(fù)折疊過程中沒有發(fā)生聚集［9］。

1．3．4 大豆蛋白去折疊和復(fù)折疊過程中圓二色譜(CD)的測定

采用CD測定大豆蛋白去折疊和復(fù)折疊過程中的遠(yuǎn)紫外CD圖譜(200～250 nm)，25℃條件下采用寬度0．5 cm比色皿測定。

1．3．5 大豆蛋白去折疊和復(fù)折疊過程中內(nèi)源熒光光譜的測定

采用熒光分光光度計(jì)測定大豆蛋白去折疊和復(fù)折疊過程中的內(nèi)源熒光光譜(激發(fā)波長295 nm，發(fā)射波長300～400 nm)，25℃條件下采用寬度1 cm石英比色皿測定，靈敏度設(shè)定為2。

1．3．6 大豆蛋白去折疊動力學(xué)曲線的測定

4倍體積的10 mol/L尿素溶液(溶于0．01 mol/L pH 7．0的磷酸鹽緩沖液)與1倍體積1．3．2制備的5 mg/mL蛋白質(zhì)溶液快速混合均勻，在激發(fā)波長295 nm條件下測定大豆蛋白在不含尿素λmax處熒光強(qiáng)度。25℃條件下采用寬度1 cm石英比色皿測定，靈敏度設(shè)定為2。從混合時(shí)開始計(jì)時(shí)，每隔10 s記錄一次熒光強(qiáng)度。

1．3．7 大豆蛋白復(fù)折疊動力學(xué)曲線的測定

4倍體積的10 mol/L尿素(溶于0．01 mol/L pH 7．0的磷酸鹽緩沖液)與1倍體積50 mg/mL蛋白液(溶于0．01 mol/L pH 7．0的磷酸鹽緩沖液)混合均勻后在25℃水浴條件下放置12 h，隨后取出0．5 mL蛋白溶液與 4．5 mL 0．01 mol/L pH 7．0 的磷酸鹽緩沖液混合，使得尿素濃度從8 mol/L迅速稀釋至0．8 mol/L，同時(shí)在激發(fā)波長295 nm條件下測定大豆蛋白樣品在不含尿素λmax處熒光強(qiáng)度。25℃條件下采用寬度1 cm石英比色皿測定，靈敏度設(shè)定為2，從混合時(shí)開始計(jì)時(shí)，每隔20 s記錄一次熒光強(qiáng)度。

2 蛋白質(zhì)變性的二態(tài)模型

二態(tài)模型認(rèn)為蛋白質(zhì)在變性過程中只存在兩種狀態(tài):天然態(tài)和變性態(tài)。測定不同變性狀態(tài)下蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)參數(shù)，并結(jié)合相關(guān)熱力學(xué)方程就可得到蛋白質(zhì)的熱力學(xué)參數(shù)［10］。CD光譜中222 nm平均摩爾橢圓率(［θ］222)和內(nèi)源熒光光譜中最大熒光峰位(λmax)熒光強(qiáng)度可表征蛋白質(zhì)在變性過程中二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的變化。

式中:α為蛋白質(zhì)去折疊分?jǐn)?shù)，F(xiàn)0為不含尿素時(shí)［θ］222或 λmax處熒光強(qiáng)度，F(xiàn)d為含 8 mol/L 尿素時(shí)［θ］222或λmax處熒光強(qiáng)度，F(xiàn)n為含不同濃度尿素(0～8 mol/L 之間)時(shí)［θ］222或 λmax處熒光強(qiáng)度。

蛋白質(zhì)變性的平衡常數(shù) K=α/(1－α) (2)

自由能的改變量ΔG=－R×T×ln K (3)

ΔG=ΔGH2O－m［尿素濃度］ (4)

式中:ΔGH2O為不含尿素時(shí)蛋白質(zhì)的ΔG，可表征蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性;m為去折疊和復(fù)折疊過程中蛋白質(zhì)分子的協(xié)同性，可表征蛋白質(zhì)在去折疊和復(fù)折疊過程中暴露疏水氨基酸的數(shù)量。結(jié)合公式(1)～公式(3)可求解出含不同濃度尿素時(shí)蛋白質(zhì)的ΔG，代入公式(4)中可得到ΔGH2O和m。ΔGH2O與m的比值是［尿素］1/2，即去折疊分?jǐn)?shù)為0．5時(shí)對應(yīng)的尿素濃度，也可表征蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性 。

3 結(jié)果與討論

3．1 蛋白質(zhì)氧化對大豆蛋白去折疊和復(fù)折疊過程中［θ］222的影響

前期研究［5］發(fā)現(xiàn)HPODE氧化大豆蛋白的氧化程度隨著HPODE添加濃度的增加而逐漸增大。圖1為氧化大豆蛋白在去折疊和復(fù)折疊過程中［θ］222隨著尿素濃度的變化曲線。在圖1a氧化大豆蛋白去折疊過程中，隨著尿素濃度的增加，［θ］222絕對值逐漸下降，表明氧化大豆蛋白α－螺旋結(jié)構(gòu)逐漸遭到破壞。在圖1b氧化大豆蛋白復(fù)折疊過程中，隨著尿素濃度逐漸被稀釋，氧化大豆蛋白［θ］222絕對值逐漸增加，表明氧化大豆蛋白α－螺旋結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)，但α－螺旋結(jié)構(gòu)恢復(fù)程度與蛋白質(zhì)氧化程度有關(guān)，大豆蛋白氧化程度越高，α－螺旋結(jié)構(gòu)恢復(fù)程度越低。

圖1 氧化大豆蛋白去折疊和復(fù)折疊過程中［θ］222隨著尿素濃度的變化曲線

3．2 蛋白質(zhì)氧化對大豆蛋白去折疊和復(fù)折疊過程中內(nèi)源熒光光譜的影響

圖2為氧化大豆蛋白在去折疊和復(fù)折疊過程中在不含尿素λmax處熒光強(qiáng)度和λmax隨尿素濃度的變化曲線。在氧化大豆蛋白去折疊過程中(圖2a)，隨著尿素濃度的增加，氧化大豆蛋白在不含尿素λmax處熒光強(qiáng)度逐漸下降，λmax發(fā)生紅移。熒光強(qiáng)度下降和λmax紅移是由于大豆蛋白在去折疊過程中色氨酸殘基與蛋白質(zhì)內(nèi)部特定淬滅劑空間距離減小引起的，蛋白質(zhì)內(nèi)部特定淬滅劑主要包括質(zhì)子化的羰基和咪唑基、去質(zhì)子化的ε－氨基以及酪氨酸鹽等極性基團(tuán)［11］，表明氧化大豆蛋白發(fā)生了去折疊反應(yīng)。在氧化大豆蛋白復(fù)折疊過程中(圖2b)，隨著尿素濃度逐漸被稀釋，氧化大豆蛋白在不含尿素λmax處熒光強(qiáng)度逐漸上升，λmax發(fā)生藍(lán)移，表明氧化大豆蛋白在復(fù)折疊過程中三級結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)。復(fù)折疊過程中大豆蛋白三級結(jié)構(gòu)恢復(fù)程度與蛋白質(zhì)氧化程度有關(guān)，大豆蛋白氧化程度越高，三級結(jié)構(gòu)恢復(fù)程度越低。

圖2 氧化大豆蛋白去折疊和復(fù)折疊過程中在不含尿素λmax處熒光強(qiáng)度和λmax隨尿素濃度的變化曲線

3．3 蛋白質(zhì)氧化對大豆蛋白去折疊和復(fù)折疊熱力學(xué)參數(shù)的影響

蛋白質(zhì)變性熱力學(xué)研究中常采用二態(tài)模型分析，但二態(tài)模型也存在一定的應(yīng)用范圍。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在去折疊過程中形成去折疊中間體或者在復(fù)折疊過程中形成聚集體時(shí)，蛋白質(zhì)的去折疊和復(fù)折疊反應(yīng)就不符合二態(tài)模型［10］。去折疊中間體和復(fù)折疊聚集體的存在使得采用二態(tài)模型依據(jù)不同結(jié)構(gòu)特征測定方法計(jì)算出來的ΔGH2O值相差很大，因此常常采用比較依據(jù)不同結(jié)構(gòu)特征測定方法計(jì)算出來的ΔGH2O值來判斷蛋白質(zhì)變性是否符合二態(tài)模型［12］。［θ］222表征和內(nèi)源熒光強(qiáng)度表征得到的大豆蛋白熱力學(xué)參數(shù)分別見表1和表2，對比兩表數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn)兩種結(jié)構(gòu)表征方法得到的ΔGH2O值比較接近，表明氧化大豆蛋白在尿素中的去折疊和復(fù)折疊反應(yīng)基本符合二態(tài)模型，因此可采用二態(tài)模型分析氧化修飾對大豆蛋白熱力學(xué)參數(shù)的影響。

從表1和表2中可看出氧化大豆蛋白在去折疊和復(fù)折疊過程中的ΔGH2O和［尿素］1/2值均隨著蛋白質(zhì)氧化程度的增加而減小，表明氧化修飾使得大豆蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降。氧化大豆蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降主要是由以下原因造成的:(1)氧化修飾使得大豆蛋白二硫鍵含量下降。二硫鍵是維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的重要作用力之一，蛋白質(zhì)在尿素中的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與二硫鍵數(shù)量密切相關(guān)［13］。Pace等［14］指出破壞核糖核酸酶T1中二硫鍵能夠?qū)е略撁冈谀蛩刂凶杂赡茏兓考眲∠陆怠hou等［15］研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)內(nèi)皮生長抑素中一個半胱氨酸殘基定點(diǎn)突變?yōu)楸彼釙r(shí)，該蛋白由于二硫鍵含量減少而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性大幅下降。前期研究［5］發(fā)現(xiàn)高濃度HPODE氧化修飾使得大豆蛋白二硫鍵含量顯著下降。(2)氧化修飾導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集。Santini等［16］認(rèn)為氧化蛋白聚集體的存在會導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降。前期研究［5］中的分子量分布結(jié)果表明HPODE修飾導(dǎo)致大豆蛋白聚集，而氧化蛋白質(zhì)聚集體可認(rèn)為是一種錯折疊體，錯折疊體的存在可導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降［17］。

表1 ［θ］222表征氧化大豆蛋白去折疊和復(fù)折疊過程得到的熱力學(xué)參數(shù)

表2 在不含尿素λmax處熒光強(qiáng)度表征氧化大豆蛋白去折疊和復(fù)折疊過程得到的熱力學(xué)參數(shù)

從表1和表2還可看出氧化大豆蛋白在去折疊和復(fù)折疊過程中的m值隨著蛋白質(zhì)氧化程度的增加而減小，說明蛋白質(zhì)氧化使得大豆蛋白變性時(shí)暴露出的疏水性氨基酸數(shù)量下降或者分子協(xié)同性降低，這主要是由以下原因造成的:(1)蛋白質(zhì)氧化將大豆蛋白中的疏水基團(tuán)轉(zhuǎn)化成為親水基團(tuán)，使得蛋白質(zhì)表面疏水性下降;(2)蛋白質(zhì)氧化導(dǎo)致大豆蛋白聚集，疏水鍵也參與聚集體的形成，當(dāng)共價(jià)交聯(lián)也參與到聚集體形成時(shí)，包裹疏水鍵的可溶聚集體可發(fā)展成為不可溶聚集體，進(jìn)一步使得疏水性氨基酸殘基數(shù)量下降。以上兩點(diǎn)在前期研究［5］中已經(jīng)詳細(xì)說明和論證。(3)氧化聚集體作為錯折疊體可降低大豆蛋白分子的協(xié)同性［17］。

3．4 蛋白質(zhì)氧化對大豆蛋白去折疊和復(fù)折疊速率的影響

在氧化大豆蛋白去折疊過程中(圖3a)，大豆蛋白熒光強(qiáng)度隨著時(shí)間的延長而逐漸下降。在8 mol/L尿素變性條件下，天然大豆蛋白在4 000 s左右去折疊反應(yīng)達(dá)到平衡態(tài)，而氧化大豆蛋白去折疊反應(yīng)達(dá)到平衡態(tài)對應(yīng)的時(shí)間隨著蛋白質(zhì)氧化程度的增加而逐漸下降，表明氧化修飾使得大豆蛋白去折疊反應(yīng)速率增大。在氧化大豆蛋白復(fù)折疊過程中(圖3b)，隨著時(shí)間的增加，大豆蛋白熒光強(qiáng)度逐漸增大。將8 mol/L尿素完全去折疊大豆蛋白溶液中的尿素濃度迅速稀釋10倍，完全去折疊態(tài)天然大豆蛋白在2 000 s左右復(fù)折疊反應(yīng)達(dá)到平衡狀態(tài)，隨著蛋白質(zhì)氧化程度的增加，完全去折疊態(tài)氧化大豆蛋白復(fù)折疊反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)間逐漸增加，說明蛋白質(zhì)氧化使得大豆蛋白復(fù)折疊反應(yīng)速率減小。

圖3 氧化大豆蛋白去折疊和復(fù)折疊過程中熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化曲線

目前有關(guān)氧化修飾對蛋白質(zhì)去折疊和復(fù)折疊速率影響的研究報(bào)道極少，文獻(xiàn)檢索僅僅發(fā)現(xiàn)Prinsze等［18］做過類似的研究，Prinsze 等［18］發(fā)現(xiàn)羥自由基氧化導(dǎo)致3－磷酸甘油醛脫氫酶、氧化還原酶以及醇脫脂酶復(fù)折疊速率增大，而單線態(tài)氧氧化則導(dǎo)致肌球蛋白復(fù)折疊速率下降，說明蛋白質(zhì)氧化對蛋白質(zhì)復(fù)折疊速率的影響同時(shí)與蛋白質(zhì)氧化類型以及蛋白質(zhì)種類有關(guān)。

4 結(jié)論

氧化大豆蛋白在尿素變性環(huán)境中的去折疊反應(yīng)和復(fù)折疊反應(yīng)基本符合二態(tài)模型。HPODE氧化修飾使得大豆蛋白在尿素變性環(huán)境中的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降。HPODE氧化大豆蛋白易于發(fā)生去折疊反應(yīng)，而不易發(fā)生復(fù)折疊反應(yīng)，這主要是由于氧化大豆蛋白二硫鍵含量和表面疏水性下降以及形成氧化聚集體造成的。

［1］Shacter E．Quantification and significance of protein oxidation in biological samples［J］．Drug Metabolism Reviews，2000，32(3－4):307－326

［2］Wu W，Zhang C M，Kong X Z，et al Oxidative modification of soy protein by peroxyl radicals［J］．Food Chemistry，2009，116(1):295－301

［3］Wu W，Zhang C M，Hua Y F．Structural modification of soy protein by the lipid peroxidation product malondialdehyde［J］．Journal of the Science of Food and Agriculture，2009，89(8):1416－1423

［4］Wu W，Wu X J，Hua Y F．Structural modification of soy protein by the lipid peroxidation product acrolein［J］．LWT －Food Science and Tech－nology，2010，43(1):133 －140

［5］Wu W，Hou L，Kong X Z，et al Structural modification of soy protein by 13 － hydroperoxyoctadecadienoic acid［J］．European Food Research and Tech－nology，2009，229(5):771 －778

［6］Fruebis J，Parthasarathy S，Steinberg D．Evidence for a concerted reaction between lipid hydroperoxides and polypeptides［J］．Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1992，89(22):10588 －10592

［7］Nir I，F(xiàn)eldman Y，Aserin A，et al Surface properties and emulsification behavior of denatured soy proteins［J］．Journal of Food Science，2006，59(3):606 －610

［8］Hidalgo F J，Kinsella JE．Changes induced in β －lactoglobulin Bfollowing interactions with linoleic acid 13－h(huán)ydroperoxide［J］．Journal of Agricultural and Food Chemistry，1989，37(4):860－866

［9］Patel S，Chaffotte A F，Goubard F，et al Urea － induced sequential unfolding of fibronectin:a fluorescence spectroscopy and circular dichroism study［J］．Biochemistry，2004，43(6):1724－1735

［10］Eftink M R，Ionescu R．Thermodynamics of protein unfolding:questions pertinent to testing the validity of the two－ state model［J］．Biophysical Chemistry，1997，64(1 － 3):175－197

［11］Halfman CJ，Nishida T．Nature of the alteration of the fluorescence spectrum of bovine serum albumin produced by the binding of dodecyl sulfate［J］．Biochim Biophys Acta，1971，243(2):294－303

［12］Guo SY，Guo Z，Chen BY，et al Urea induced inactivation and unfolding of arginine kinase from the sea cucumber stichopus japonicus［J］．Biochemistry，2003，68(11):1575 －1580

［13］Zhou N E，Kay C M，Hodges R S．Disulfide bond contribution to protein stability:positional effects of substitution in the hydrophobic core of the two－stranded alpha－h(huán)elical coiled － coil［J］．Biochemistry，1993，32(12):3178 － 3187

［14］Pace C N，Grimsley G R，Thomson J A，et al Conformational stability and activity of ribonuclease T1 with zero，one，and two intact disulfide bonds［J］．Journal of Biological Chemistry，1988，263:11820 －11825

［15］Zhou H，Wang W，Luo Y Z．Contributions of disulfide bonds in a nested pattern to the structure，stability，and biological functions of endostatin［J］．Journal of Biological Chemistry，2005，280(12):11303 －11312

［16］Santini SA，Mordente A，Meucci E，et al Conformational stability of bovineα －crystallin．Evidence for a destabilizing effect of ascorbate［J］．Biochemical Journal，1992，287:107 －112

［17］Dobson C M．Protein folding and misfolding［J］．Nature，2003，426(6989):884 －890

［18］Prinsze C，Dubbelman T M A R，Steveninick J V．Protein damage，induced by small amounts of photodynamically generated singlet oxygen or hydroxyl radicals［J］．Biochimica et Biophysica Acta，1990，1038(2):152 －157．

Effects of Oxidative Modification by Lipid Hydroperoxide on Unfolding and Refolding Properties of Soy Protein

Wu Wei1，2Lin Qinlu1，2Hua Yufei3
(School of Food Science and Engineering，Central South University of Forestry and Tech－nology1，Changsha 410004)
(Hunan Key Laboratory of Grain － oil Process and Quality Control2，Changsha 410004)
(School of Food Science and Tech－nology，Jiangnan University3，Wuxi 214122)

13－h(huán)ydroperoxy－9Z，11E －octadecadienoic acid(HPODE)was selected as the representatives of lipid hydroperoxides to investigate effects of oxidative modification by a serial concentration of lipid hydroperoxide on the unfolding and refolding properties of soy protein which was characterized by circular dichroism and intrinsic fluorescence．Results showed that:the extent of oxidized soy protein structural recovery during refolding process decreased as the extent of soy protein oxidation increased．As extent of protein oxidation increased，ΔGH2O，m，and［Urea］1/2of oxidized soy protein gradually decreased．The phenomena indicated that oxidative modification led to a decrease in protein structural stability．In addition，oxidative modification also resulted in an increase in the unfolding rate of soy protein in urea，but a decrease in the refolding rate of soy protein．

soy protein，oxidative modification，unfolding，refolding

TS201．2+1

A

1003－0174(2011)07－0017－06

國家自然科學(xué)基金(20876069)，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室目標(biāo)導(dǎo)向課題(SKLF－MB－200803)

2010－09－14

吳偉，男，1981年出生，講師，博士，糧食及植物蛋白