唐晶 謝柏臻 李鵬飛 姚琴 趙渙閣 卓慧欽 劉祖國 趙永祥
綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)最初是Shimomura等[1]從維多利亞發(fā)光水母中發(fā)現(xiàn)的,是一個有238個氨基酸的單體發(fā)光蛋白,相對分子質(zhì)量為27000~30000[2-4]。該蛋白不需要輔因子即能自身催化形成發(fā)色結(jié)構(gòu),受 近紫外光或藍(lán)光(395 nm 處有最大吸收峰,在470 nm 處有小吸收峰)激發(fā)下可發(fā)出綠色熒光(發(fā)射峰509 nm,540 nm處有肩峰)。增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)是將Thr和Leu氨基酸分別置換Ser65和Phe64后 的綠色熒光蛋白,使GFP的熒光強(qiáng)度提高了35倍,增強(qiáng)了其報告基因的敏感度[5]。EGFP作為一個多功能的分子,它在生物科學(xué)領(lǐng)域里有著廣泛應(yīng)用,如蛋白質(zhì)的相互作用和酶的活性研究、藥物監(jiān)測、基因表達(dá)和蛋白定位、腫瘤疫苗療效觀察和目標(biāo)蛋白熒光標(biāo)記等[6-17]。
除靈長類和人類外,α 半乳糖抗原 [Galα1-3Galβ1-(3) 4GlcNAc-R,即 Galα(1,3)Gal抗原 ]是由其他所有非靈長類哺乳動物細(xì)胞的α半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(α-1,3Galactosyltransperase,即α1,3GT)催化合成的糖蛋白。盡管由于α1,3GT基因進(jìn)化時因缺失或替代成為假基因,人和舊世紀(jì)靈長類中不表達(dá)Galα(1,3)Gal抗原決定簇[18]。但是,作為對攜帶Galα(1,3)Gal 糖基結(jié)構(gòu)的胃腸道菌群和其他致病原的免疫應(yīng)答結(jié)果,人和舊世紀(jì)靈長類出生后體內(nèi)就產(chǎn)生了抗Gal表位的天然抗體[19-20]。在異種移植時(如豬器官植入人體),抗Gal抗體結(jié)合豬血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的αGal抗原,引起超急性排斥反應(yīng),最終導(dǎo)致移植物的失活壞死。據(jù)此,本課題擬通過對人腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染豬α1,3GT與EGFP融合基因表達(dá)融合蛋白的過程,使人腫瘤細(xì)胞表達(dá)豬αGal抗原,從而與人體內(nèi)天然抗Gal抗體結(jié)合誘發(fā)超急性排斥反應(yīng),實現(xiàn)抗腫瘤作用,以便日后能通過熒光顯微鏡觀察融合蛋白生成情況來了解目標(biāo)基因在活體內(nèi)的示蹤表達(dá),實現(xiàn)目的基因α1,3GT靶向殺傷腫瘤細(xì)胞效應(yīng)的有效監(jiān)測分析。
本研究即試圖了解豬α1,3GT與EGFP基因融合后對綠色熒光蛋白表達(dá)的影響,為判斷豬α1,3GT基因抗腫瘤疫苗的療效奠定基礎(chǔ)。
質(zhì)粒及菌種:外源基因α1,3GT,pCDNA3.1/α1,3GT本室構(gòu)建;pEGFP-N1(含CMV啟動子和EGFP基因)、DH5α菌株為本室保存。細(xì)胞株:A549和293FT為本室保存。主要試劑:DMEM培養(yǎng)液(Hyclone公司);小牛血清、胰酶(GIBCO公司),Lipofectimine 2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司);雙抗(Hyclone公司);質(zhì)粒小提試劑盒、連接試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamHI,EcoRI、目的 DNA 回收與純化試劑(Takara公司);卡那霉素(Sigma分裝);熒光顯微鏡(Nikon);流式細(xì)胞儀 (Beckman)。
1.pEGFP/α1,3GT 真核表達(dá)載體的構(gòu)建:pEGFP-N1和pCDNA3.1/ α1,3GT 均用 BamHI、EcoRI雙酶切,回收1050 bp的α1,3GT目的片段。將該片段和pEGFP-N1載體16℃連接3 h。取10μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,提取、酶切鑒定,構(gòu)建含EGFP的真核表達(dá)載體(圖1)。
2.質(zhì)粒pEGFP-N1和pEGFP/α1,3GT轉(zhuǎn)染A549、293FT細(xì)胞:用含10﹪滅活胎牛血清及1﹪雙抗的DMEM培養(yǎng)液在37℃、5﹪CO2條件下,常規(guī)培養(yǎng)A549、293FT細(xì)胞2~3 d后,用0.25﹪胰酶消化傳代。將細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,培養(yǎng)過夜,使達(dá)到80﹪~90﹪細(xì)胞融合度。設(shè)空白對照組(未轉(zhuǎn)染組)、實驗對照組(轉(zhuǎn)染pEGFP-N1組)和實驗組(轉(zhuǎn)染pEGFP/α1,3GT),用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染,即6孔板每孔加約4.0 μg質(zhì)粒和10μl脂質(zhì)體。
3.熒光顯微鏡檢測EGFP的表達(dá):A549和293FT細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h、48h和72h,分別在熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達(dá)情況。每一孔取10個視野進(jìn)行觀察、計數(shù),并照相,照相時采取曝光時間保持一致,即150 ms。熒光顯微鏡檢測EGFP的轉(zhuǎn)染陽性率計算方法:6孔 細(xì)胞培養(yǎng)板中選取每個樣本各10個視野,均在200倍鏡下觀察,先觀察正常白光視野中細(xì)胞數(shù)目,再在同一視野中轉(zhuǎn)為觀察綠色熒光表達(dá),計算每個視野表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)后,計算出一個視野中綠色熒光陽性表達(dá)率(保證所選取的視野中細(xì)胞數(shù)在200左右)。每個樣本共計算10個視野的綠色熒光陽性表達(dá)率,然后再求相同樣本的10個視野平均綠色熒光陽性表達(dá)率。
4.流式細(xì)胞儀對EGFP的表達(dá)進(jìn)行檢測、定量:轉(zhuǎn)染后48h的A549和293FT細(xì)胞,用PBS清洗2次,胰酶消化,用PBS制成懸液,200目銅網(wǎng)過濾,再分別上機(jī)進(jìn)行綠色熒光檢測。
圖1 重組質(zhì)粒pEGFP-α1,3GT構(gòu)建圖
BamHI、EcoRI雙酶切pcDNA3.1/alpha1,3GT回收的1050 bp α1,3GT片段與pEGFP-N1載體連接,得到的重組質(zhì)粒用BamHI、EcoRI雙酶切 鑒定,切出1050 bp插入目的片段和4700 bp大小的pEGFP-N1載體片段,重組質(zhì)粒的構(gòu)建(圖1)。
pEGFP-N1載體轉(zhuǎn)染A549和293FT后48h的轉(zhuǎn)染陽性率分別80.5﹪和86.5﹪;pEGFP/α1,3GT載體轉(zhuǎn)染A549和293FT細(xì)胞后48h的轉(zhuǎn)染效率則為75.8﹪和81.2﹪。轉(zhuǎn)染pEGFP/α1,3GT組的熒光細(xì)胞數(shù)和熒光強(qiáng)度明顯低于pEGFP-N 1組,空白對照組無熒光出現(xiàn)(圖2);轉(zhuǎn)染48h后激光共聚焦顯微鏡下 觀察融合蛋白的定位(圖3)。
圖2 轉(zhuǎn)染后48h的A549細(xì)胞和293FT細(xì)胞熒光圖
圖3 轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞系
未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞為空白對照,轉(zhuǎn)染pEGFP-N1和pEGFP/α1,3GT載體的A549細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度分別為1.21、0.956;未轉(zhuǎn)染的293FT細(xì)胞空白對照,pEGFP-N1和pEGFP/α1,3GT載體的293FT細(xì)胞平均 熒光表達(dá)量分別為7.66、1.00,即pEGFP-N1和pEGFP/α1,3GT兩組熒光表達(dá)強(qiáng)度均明顯高于空白對照組,但pEGFP/α1,3GT組則明顯低于pEGFP-N1組(圖4)。
圖4 熒光強(qiáng)度流式檢測
報告基因已普遍應(yīng)用于基因治療研究中。EGFP作為報告基因的優(yōu)勢在于其熒光強(qiáng)度高,可在普通熒光顯微鏡下觀測,不需要反應(yīng)底物與輔助因子,相對較小的分子和單體蛋白使之易于融合,不干擾正常細(xì)胞活動等優(yōu)點(diǎn)。
本實驗中,構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEGFP/α1,3GT在同一細(xì)胞株A549和293FT轉(zhuǎn)染的結(jié)果中,pEGFP/α1,3GT表達(dá)載體的熒光強(qiáng)度明顯低于pEGFP-N1載體。究其原因,一方面可能是因為α1,3GT基因插入在pEGFP-N1的C端,融合蛋白的分子量比單一的EGFP蛋白分子量要大,在蛋白構(gòu)象的空間結(jié)構(gòu)上可能會影響綠色熒光發(fā)光結(jié)構(gòu)的形成;另一方面,熒光強(qiáng)度的高低還和細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染難易相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞株A549和293FT轉(zhuǎn)染相同的質(zhì)粒后,熒光強(qiáng)度也出現(xiàn)差異,但是在融合前pEGFP-N1表達(dá)強(qiáng)度要顯著高于重組融合后pEGFP/α1,3GT質(zhì)粒的熒光強(qiáng)度,提示EGFP尚需進(jìn)一步改造以提高綠色熒光融合蛋白的表達(dá)量;而基因工程合成融合蛋白的方法及融合蛋白表達(dá)的穩(wěn)定性等也有待完善。因此,在選擇含目的 基因綠色熒光融合蛋白作為抗腫瘤示蹤療效評估時,可能需要注意以下幾點(diǎn):(1)外源基因轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞后,綠色熒光強(qiáng)度會有所下降,這有可能給我們對目的基因表達(dá)定位的判斷造成一定影響;(2)綠色熒光融合蛋白的表達(dá)是否會影響目的基因的功能表達(dá),從Huang等[21]對ZZ-EGFP融合蛋白的研究表明,融合蛋白的表達(dá)沒有 明顯影響目的基因功能的表達(dá),且ZZ-EGFP融合蛋白能夠保持所有期望 特性,即保持極高的可溶性和相當(dāng)高的產(chǎn)量,這與本研究的結(jié)果一致(實驗資料另文發(fā)表);(3)EGFP是否對細(xì)胞有毒性。如果EGFP對細(xì)胞有毒性,細(xì)胞狀態(tài)不佳將直接影響轉(zhuǎn)染效率,那么必將導(dǎo)致綠色熒光融合蛋白表達(dá)量的下降。Alexander和Gotoh等[22-23]將目的基因片段克隆到pEGFP-C1載體構(gòu)建重組質(zhì)粒,發(fā)現(xiàn)EGFP對細(xì)胞是沒有毒性的,與本研究觀察到EGFP對細(xì)胞沒有明顯毒性相似。而Liu等[24]卻發(fā)現(xiàn)NIH/3T3和BHK-21細(xì)胞系在轉(zhuǎn)染EGFP后不久就發(fā)生凋亡,這可能與不同細(xì)胞株的耐受性不一樣有關(guān)。
目的基因治療腫瘤在理論上來說是一種有效的方法,但在實際的操作過程當(dāng)中還存在著許多需要改進(jìn)的地方。隨著對融合蛋白形成機(jī)制及融合基因合成過程中發(fā)生的變異、突變和輔助性因子的介入等方面研究的深入,相信基因治療在腫瘤治療中一定會有突破性的進(jìn)展。
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