龍志晶 王春芳＊ 李鵬飛 劉彩玉 鄧春圣 呼鐘理

干擾骨髓基質(zhì)細胞 Hes1基因?qū)ash1基因表達的影響

龍志晶1王春芳1＊李鵬飛1劉彩玉1鄧春圣2＊呼鐘理3

(1山西醫(yī)科大學生物技術(shù)教研室,太原030001;2中國人民解放軍第322醫(yī)院,山西大同037006;3太原市中醫(yī)醫(yī)院,太原030002)

目的 觀察對體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細胞 Hes1基因干擾后Mash1基因的表達變化。方法 采用全骨髓培養(yǎng)法體外分離培養(yǎng)獲得骨髓基質(zhì)細胞,倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)變化,應用實時定量PCR技術(shù)分析在干擾 Hes1基因表達的情況下Mash1基因表達的變化。結(jié)果 應用200nM,100nM,50nM,25nM四種不同濃度梯度的Hes1的siRNA干擾抑制Hes1基因,與對照組相比 Hes1表達均降低。200nM干擾后 Hes1基因降低的程度是原來的0.036(P<0.05),50nM干擾后 Hes1基因降低的程度是原來的0.076(P<0.05),優(yōu)于其他濃度的干擾效果。Hes1降低可使Mash1基因表達增加,且 Hes1降低越顯著,Mash1表達增加越高。結(jié)論 體外培養(yǎng)BMSCs過程中干擾Hes1基因?qū)ash1基因的表達有影響,且呈負相關(guān)調(diào)控關(guān)系。

骨髓基質(zhì)細胞; 基因表達; Hes1基因; Mash1基因; RNAi

在成體非神經(jīng)組織源性神經(jīng)干細胞研究中,骨髓基質(zhì)細胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)是近年來干細胞領(lǐng)域的研究熱點,其具有干細胞自我更新、高度增殖能力和多向分化的潛能。有研究發(fā)現(xiàn)BMSCs在體內(nèi)外特定條件下可以向多種間質(zhì)細胞分化[1,2],還可以分化為神經(jīng)元細胞[3]。因此,其又稱骨髓基質(zhì)細胞源神經(jīng)干細胞(bone marrowderived neural stem cells)[4]。目前,BMSCs已成為一種理想的種子細胞,在神經(jīng)再生領(lǐng)域有著廣泛的應用前景,但其定向分化為神經(jīng)元的分子調(diào)控機制仍不清楚。神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因Hes1和Mash1基因?qū)儆赽 HL H蛋白家族,研究發(fā)現(xiàn),它們廣泛表達于發(fā)育中的外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)[5]。Hes1(Hairy and enhancer of split 1)在維持神經(jīng)干細胞增殖,分化為適當數(shù)量的細胞及分化的多樣性方面具有重要的作用;Mash1(Mammalian achaete-scute homolog 1)作為其下游基因,參與了神經(jīng)前體細胞的產(chǎn)生以及促進這些多潛能前體細胞向不同類型的神經(jīng)元分化。本實驗通過 RNAi技術(shù)在體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs中干擾 Hes1基因的表達,觀察Mash1基因的表達變化,了解在體外培養(yǎng)的BMSCs中 Hes1和Mash1兩者之間的關(guān)系。

材料和方法

1.試劑

B27(Sigma),DMEM(Gibco),Opti-MEM(Sigma),LipofectimineTM2000 Reagent(Sigma),siRNA(Sigma),胎牛血清(杭州四季青公司),RT-PCR試劑(Takara),CD71山羊抗大鼠一抗(BOSTER),FITC標記的兔抗山羊二抗(BOSTER),超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司,SW-CJ-1FD),低溫高速離心機(美國 Heraeus),CO2培養(yǎng)箱(美國 Thermo Forma,3100),高壓蒸汽消毒器(北京市永光明醫(yī)療儀器廠,GMSX-280),PCR擴增儀(美國 ABI,7300),相差顯微鏡(日本OL YMPUS,CK40)。

2.大鼠BMSCs的培養(yǎng)與鑒定

將120 g左右的雄性 Wistar大鼠腹腔注射1 ml肝素后,10%水合氯醛(0.4ml/100g)麻醉,用75%乙醇浸泡大鼠消毒10分鐘,無菌條件下取出大鼠的股骨和脛骨,分別剪去股骨和脛骨的兩端,用D-Hanks液沖洗骨髓腔2～3次,將提取的骨髓反復抽吸并制成細胞懸液。收集細胞懸液并轉(zhuǎn)移至15 ml的離心管中,玻璃滴管吹打成單細胞懸液,1000 r/min,離心5 min后棄上清;將細胞沉淀用含10%胎牛血清的DM EM培養(yǎng)基懸浮,接種在六孔培養(yǎng)板中,在37℃、5%CO2孵箱內(nèi)進行原代培養(yǎng);3 d后更換培養(yǎng)液,除去未貼壁細胞,以后每3 d換液一次,待原代培養(yǎng)的細胞70%以上匯合時,用含0.25%胰酶的消化液消化細胞,并按1:2進行傳代培養(yǎng);傳至第三代,用CD71免疫熒光技術(shù)鑒定細胞。

3.siRNA干擾

將新鮮傳至P3代細胞轉(zhuǎn)染前1～2天,用胰酶消化細胞并計數(shù),使其在轉(zhuǎn)染日密度為70～90%,細胞鋪板在2 mlOpti-MEM培養(yǎng)基中;分別使用250μl Opti-M EM 稀釋 siRNA 和 5μl的LipofectimineTM2000 Reagent試劑,室溫孵育5分鐘后,混合稀釋的siRNA和稀釋的LipofectimineTM2000 Reagent試劑,室溫孵育20分鐘;將復合物加入到每孔中,使 siRNA終濃度分別為200nM,100nM,50nM,25nM;6小時后更換為含血清含抗生素的正常培養(yǎng)基,在37℃的CO2孵箱中保溫72小時。

4.總RNA的提取

分別收集未進行RNA干擾組和RNA高濃度干擾組、低濃度干擾組細胞進行對照,每孔細胞用1ml RNAiso Reagent試劑(Ta KaRa)按說明書進行操作提取總 RNA,并用紫外分光光度計定量(D260/D280=1.8～2.0)。

5.實時定量PCR檢測 Hes1和Mash1的表達

第一步:對提取的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應,逆轉(zhuǎn)錄反應體系 10μl中含:2μg 總 RNA、1mMdNTP、5×M-MLV buffer、10 U RNase Inhibitor、50 μM Oligo(d T)、RTaseM-MLV(RNase H-)50 U。42℃反應1h后,70℃保溫15 min冰上冷卻,將所得cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

第二步:實時熒光定量 PCR:用ABI公司的引物設計軟件 Primer Express設計實時熒光定量PCR的 Hes1、Mash1和18S r RNA引物。以實時熒光定量PCR來檢測未干擾及用不同濃度siRNA干擾 Hes1后Mash1表達變化情況,18s為內(nèi)參照。20μl的反應體系包括:10μl的 2 ×SYBR Green Master Mix(ABI公司的 SYBR Green試劑盒),10μM 的上下游引物各 1μl,1 ul cDNA。在 ABI 7300型定量 PCR儀上以下列條件進行擴增:95℃10 min,95℃15 S,60℃1 min,循環(huán) 40次(表 1)。采用比較 CT值法,應用 RQ study軟件(Applied Biosystems)進行miRNAS的相對定量分析。

表1 Hes1,Mash1,18Sr RNA基因的引物序列Table 1 Primer sequences of Hes1,Mash1,18Sr RNA for Real-time PCR

6.統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)用均數(shù) ±標準差(ˉx±s)表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析,多組間指標的比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),LSD檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.分離培養(yǎng)BMSCs的形態(tài)學特點

經(jīng)分離的骨髓細胞懸液培養(yǎng)3d后全量換液,去除未貼壁細胞,可見貼壁生長的細胞大部分呈梭形,呈旋渦狀生長,少部分呈多角形,細胞核居中,折光性強。貼壁細胞呈單層生長,生長迅速,細胞呈團簇狀,分布不均,顯示出集群生長趨勢。之后細胞相互間漸緊密貼附,呈條索狀匯合。7d左右細胞達到70%以上的匯合。P3以后的細胞形態(tài)較為均一(圖1)。傳代細胞形態(tài)呈多角形,隨著傳代次數(shù)增加,細胞突起增多。P3的細胞經(jīng)免疫熒光鑒定CD71表達陽性(圖2)。

2.干擾 Hes1后Mash1的表達變化

實時定量 PCR檢測結(jié)果顯示:Hes1基因和Mash1基因在 BMSCs P3中都有表達,分別用200nM,100nM,50nM,25 nM四組不同濃度的siRNA對 Hes1干擾后,Hes1基因表達均有所下降,200 nM和50 nM濃度組降低最顯著,認為以上四組不同濃度的siRNA與對照組相比存在統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明 Hesl基因沉默成功。高濃度(200nM)干擾組的 siRNA對 Hes1表達減弱以及Mash1表達增加的效果優(yōu)于低濃度(50nM)干擾組,基于以上結(jié)果,我們選擇200 nM和50 nM濃度組的siRNA用于檢測Mash1基因的表達,結(jié)果顯示Mash1基因表達均有所增高。因此,我們認為經(jīng)200nM和50nM的siRNA干擾Hes1后檢測Mash1基因的表達變化與對照組相比存在統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

討 論

BMSCs是一種具有多分化潛能的干細胞,在體內(nèi)外特定條件下可以橫向誘導分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞[6]。在課題組的前期實驗中,我們分析了Hes1基因和Mash1基因在BMSCs中誘導分化為神經(jīng)元過程中的表達變化情況,得出 Hes1在BMSCs表達較高,Mash1在BMSCs表達較低的結(jié)論[7]。Nakamura等的研究表明,Hes1-/-的小鼠過早地表達了早期和晚期的神經(jīng)元標志,說明 Hes1在維持神經(jīng)干細胞的增殖方面發(fā)揮了重要的作用[8]。Mash1作為 Hes1的下游基因,短暫性地表達于小鼠早期發(fā)育的神經(jīng)系統(tǒng)中,同時還是各器官在胚胎發(fā)育過程中一個重要的轉(zhuǎn)錄因子。另外,Mash1還能夠促使神經(jīng)前體細胞產(chǎn)生以及促進這些多潛能前體細胞向不同神經(jīng)元類型分化[9]。因此我們觀察了干擾Hes1基因后下游基因Mash1的表達變化情況,以期了解 Hes1和Mash1兩者之間的關(guān)系。

在Bai等人的實驗中曾使用100nM的siRNA干擾Hes1,經(jīng) siRNA轉(zhuǎn)染后的神經(jīng)干細胞 Hes1基因表達顯著降低[10]。因此,本實驗過程采用四種不同濃度梯度的 Hes1的siRNA干擾抑制BMSCs中 Hes1基因的表達,終濃度分別為 200nM,100nM,50nM,25nM的 siRNA,得出 200nM和50nM干擾效果最好的結(jié)論,但考慮到經(jīng)濟成本,我們推薦使用50nM的siRNA。故本實驗選定的最適濃度可以成為今后干擾試驗的參考濃度。

Hes1和Mash1基因均屬于b HL H轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族基因,該家族參與了動物體內(nèi)許多器官的發(fā)育過程,并發(fā)揮了重要的作用[11-13]。因此在本實驗中,我們選用終濃度為200nM和50nM的siRNA干擾組進一步檢測Mash1的表達變化,發(fā)現(xiàn)干擾Hes1基因的表達,Mash1基因的表達較干擾前增高。課題組前期實驗證明,在BMSCs的培養(yǎng)過程中,隨著傳代次數(shù)的增加,Hes1的表達呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢,而Mash1則逐漸上升,誘導分化后 Hes1較未誘導組降低,Mash1增高[7],與本實驗結(jié)果中Hes1,Mash1變化趨勢相同。據(jù)報道,Hes1高表達于神經(jīng)干細胞中,在胚胎時期 Hes1的缺失可導致胚胎發(fā)育缺陷[14]。Mash1在神經(jīng)元分化及神經(jīng)元特定亞型選擇性分化中發(fā)揮中心調(diào)控作用[15]。Alexandros等證實,降低 Hes1,Mash1 mRNA的降解率可影響神經(jīng)細胞分化的進程[16]。實驗研究發(fā)現(xiàn),在利用RNAi技術(shù)使 Hes1表達下調(diào)后,Mash1表達較未干擾組顯著上調(diào),由此我們認為 Hes1和Mash1基因在BMSCs的培養(yǎng)過程中可能有重要作用,并且 Hes1對Mash1呈負相關(guān)調(diào)控關(guān)系。

研究中我們通過對BMSCs培養(yǎng)過程中 Hes1基因的人為干擾,運用RNAi技術(shù)干擾發(fā)育調(diào)控基因 Hes1,同時利用實時定量PCR技術(shù)檢測在BMSCs傳代中,Mash1的表達變化情況。實驗結(jié)果顯示:成功地抑制 Hes1基因的表達,Mash1基因的表達較干擾前增高,Hes1和Mash1兩者之間呈負調(diào)控關(guān)系。因此本實驗可為了解BMSCs的分化機制提供了一個新的思路,也有助于對定向誘導分化關(guān)鍵因素的篩選與確定。在今后的實驗中,我們還可以把干擾作為一種誘導手段應用于BMSCs的誘導分化。

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The expression of Mash1 after the inhibition of Hes1 gene in BMSCs

Long Zhijing1,Wang Chunfang1＊,Li Pengfei1,Liu Caiyu1Deng Chunsheng2＊,Hu Zhongli3
(1Department of Biotechnology,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001;2The 322nd Hospital of PLA,Datong Shanxi 037006;3Taiyuan Hospital of Traditional Chinese Medicine,Taiyuan 030002,China)

Objective To explore the expression of Mash1 after the inhibition of the Hes1 gene in BMSCs.Methods BMSCs isolated f rom bone marrow were cultured in vitro.The morphologic feature and growth status of BMSCs and differentiated BMSCs were observed by inverted microscopy.The expression of Mash1 was analyzed by real-time quantitative PCR.Results The concentrations of Hes1 siRNA were 200nM,100nM,50nM or 25nM.The expression of Hes1 was decreased in comparison with that of the control group.The level of Hes1 at the concentration of 200nM in interfered BMSCs was 0.036-fold of that in control BMSCs(P<0.05),and the level of Hes1 at 50nM in interfered BMSCs was 0.076-fold of that in control BMSCs(P<0.05),both better than the others.The expression of the Mash1 gene was increased after the inhibition of the Hes1 gene in a dose-dependent manner.Conclusion Hes1 can down-regulate the expression of the Mash1 gene in BMSCs.

Bone marrow stromal cell; Gene expression; Hes1; Mash1; RNAi

R322.812

A

10.3870/zgzzhx.2011.03.011

2010-11-10

2011-04-01

山西省自然科學基金(2009011057-1);中國人民解放軍第322醫(yī)院自然科學基金(2011001)

龍志晶,女(1983年),漢族,碩士研究生。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)