蔡 青 姬 曼 張進(jìn)祿 趙君朋

激光共聚焦掃描顯微鏡和透射電鏡觀察大鼠紋狀體內(nèi)谷氨酸能突觸連接的對(duì)比觀察

蔡 青 姬 曼 張進(jìn)祿＊趙君朋＊

(首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)與測(cè)試中心,北京100069)

目的 探討使用激光共聚焦掃描顯微鏡 (Laser scanning confocal microscope,LSCM)觀察大鼠紋狀體內(nèi)谷氨酸能突觸連接的方法的可行性。方法 12只正常大鼠分為兩組,6只大鼠進(jìn)行紋狀體中等棘刺神經(jīng)元的CM-DiI單細(xì)胞標(biāo)記,然后Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(vesicular glutamate transporter 1,V Glu T1)免疫熒光標(biāo)記,LSCM層掃后三維重建,觀察V Glu T1陽(yáng)性位點(diǎn)在中等棘刺神經(jīng)元樹突上的分布。另外6只大鼠用 TEM觀察不對(duì)稱性突觸在紋狀體神經(jīng)元樹突上的分布。對(duì)兩種方法的結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果 用LSCM和TEM方法觀察到的紋狀體神經(jīng)元上谷氨酸能突觸連接分布情況一致,沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但LSCM更具優(yōu)越性的是,可以對(duì)圖像進(jìn)行三維重構(gòu),從而有利于對(duì)神經(jīng)元之間突觸連接的空間分布觀察和定量分析。結(jié)論 神經(jīng)細(xì)胞熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合LSCM觀察是考察紋狀體神經(jīng)元上谷氨酸能突觸連接的有效方法。

激光共聚焦顯微鏡; 透射電鏡; 免疫熒光染色; 突觸

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,基底神經(jīng)節(jié)回路參與對(duì)復(fù)雜運(yùn)動(dòng)的調(diào)控,其病變會(huì)導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)功能異常,如帕金森病和亨廷頓病等[1-3]。紋狀體是基底神經(jīng)節(jié)回路的中央加工區(qū),其中最主要的神經(jīng)元是中等棘刺神經(jīng)元,約占神經(jīng)元總數(shù)的95%[2,3]。中等棘刺神經(jīng)元主要接受來(lái)自大腦次級(jí)感覺區(qū)和更高級(jí)聯(lián)絡(luò)皮質(zhì)的谷氨酸能纖維投射。谷氨酸能投射纖維傳遞控制運(yùn)動(dòng)的信號(hào),形成紋狀體內(nèi)的絕大多數(shù)不對(duì)稱性突觸;另外,中等棘刺神經(jīng)元還接受多巴胺、γ-氨基丁酸和膽堿能纖維投射形成對(duì)稱性突觸[2-5]。不同來(lái)源的突觸信號(hào)在紋狀體中等棘刺神經(jīng)元樹突上整合,從而實(shí)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)的計(jì)劃,啟動(dòng)和終止。因此,了解中等棘刺神經(jīng)元上不同突觸的空間分布特點(diǎn),對(duì)于全面理解基底神經(jīng)節(jié)參與運(yùn)動(dòng)調(diào)控的機(jī)制具有十分重要意義。最近,激光共聚焦掃描顯微鏡 (Laser scanning confocal microscope,LSCM)技術(shù)的不斷發(fā)展,其成像分辨率大大提高;而且在圖像處理軟件的輔助下,還可實(shí)現(xiàn)圖像的三維重建。為此,本研究擬采用LSCM掃描熒光標(biāo)記中等棘刺神經(jīng)元和谷氨酸能纖維末梢,考察成年大鼠谷氨酸能纖維末梢在中等棘刺神經(jīng)元樹突上的空間分布特點(diǎn)。同時(shí),應(yīng)用透射電鏡(Transmission electron microscopy,TEM)的方法考察紋狀體神經(jīng)元樹突上不對(duì)稱性突觸的分布,對(duì)LSCM方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。

材料和方法

1.動(dòng)物與分組

12只正常雄性 SD大鼠,體重230-250g,由首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供。6只大鼠進(jìn)行中等棘刺神經(jīng)元標(biāo)記和免疫熒光染色,6只大鼠進(jìn)行透射電鏡觀察。

2.儀器與試劑

振蕩切片機(jī)(Leica公司),LSCM(Leica公司),透射電鏡(JEOL公司),CM-DiI(Invitrogen公司),兔抗V Glu T1(Sigma公司),Alexa 488標(biāo)記山羊抗兔Ig G(Invitrogen公司),氣壓式基因槍(寧波新芝公司)。

3.方法

3.1 CM-DiI包被鎢粉顆粒的制備:將50mg基因槍用鎢粉顆粒(直徑≤1.6μm)均勻撒在載玻片上,將5mg CM-DiI溶解于二氯甲烷,然后滴加到鎢粉顆粒上,二氯甲烷揮發(fā)完全后,CM-DiI包被到鎢粉顆粒上。采集鎢粉顆粒到離心管內(nèi),加入3ml去離子水,超聲振蕩5min,使鎢粉顆粒分散,4℃保存。

3.2 中等棘刺神經(jīng)元標(biāo)記:大鼠水合氯醛腹腔注射過量麻醉(80 mg/kg),先后用150ml生理鹽水和300ml含有 0.1%EDTA的2%多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)進(jìn)行左心室-升主動(dòng)脈插管灌注固定。取全腦,放入上述固定液中后固定2h。取含有紋狀體的腦組織塊,進(jìn)行連續(xù)冠狀面振蕩切片,厚度為250μm。切片在含有0.1%EDTA的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered saline,PBS)中4℃過夜 。每個(gè)腦選取 5張含有紋狀體的切片,進(jìn)行單細(xì)胞標(biāo)記:用氣壓式基因槍(0.2-0.3MPa氣壓)將上述鎢粉顆粒輸送切片上,然后將切片放入含有0.1%EDTA的 PBS中室溫放置6-8h,再轉(zhuǎn)入4℃含有0.1%EDTA的4%PFA中固定6-8h。

3.3 V Glu T1免疫熒光染色:取上述CM-DiI標(biāo)記的切片,用 0.01mol/L PBS浸洗10min×3次。然后在含有0.1%Tween-20的PBS中細(xì)胞膜打孔30min。PBS浸洗10min×3次后,用5%正常羊血清室溫下封閉抗原 1h。隨后在 1:2000兔抗V Glu T1(PBS/1%BSA配制)中孵育,4℃過夜。PBS浸洗10min×3次后,用1:400 Alexa 488標(biāo)記山羊抗兔 Ig G孵育,避光室溫2h。0.01MPBS浸洗10min×3次后,PBS封片。

3.4 LSCM觀察:選取DiI標(biāo)記的樹突進(jìn)行照相,然后用Leica LAS AF圖像處理軟件進(jìn)行三維重建。LSCM參數(shù)為63×oil immersion objective[numerical aperture,1.25];Step-size:0.3μm;optical zoom:7.5;resolution:1024×1024 pixels。對(duì)三維重建的圖片,測(cè)量樹突段與胞體的距離,計(jì)數(shù)樹突干和樹突棘上的V Glu T1陽(yáng)性位點(diǎn)的數(shù)目。

3.5 電鏡標(biāo)本制作:大鼠水合氯醛腹腔注射過量麻醉(80 mg/kg),先后用 37℃0.1mol/L PB(含100IU/ml肝素)和4℃含2%戊二醛的4%PFA(0.1MPB配制,p H7.4)進(jìn)行左心室-升主動(dòng)脈插管灌注固定。取1mm3的紋狀體組織,放3%戊二醛內(nèi)后固定3h。0.1mol/L PB浸洗10min×3次后,1%鋨酸(0.1mol/L PB配制)作用40min。脫水,樹脂包埋,超薄切片,厚度70nm,乙酰鈾和醋酸鉛復(fù)染。

3.6 透射電鏡觀察,按照隨機(jī)原則選取不對(duì)稱突觸,進(jìn)行40,000×照相。神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的認(rèn)定參考Perters A[2]:其中,樹突干為不含細(xì)胞核的突起,輪廓平滑規(guī)則,含有線粒體、尼氏體和平行排列的神經(jīng)原纖維等,但無(wú)高爾基復(fù)合體。樹突棘較樹突干小,缺乏微管和線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),存在絨毛狀物質(zhì),這些絨毛狀物質(zhì)常含有顆粒狀小團(tuán),在一些超薄切片中,樹突棘的頭部或/和頸部有棘器(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的扁平膜囊)結(jié)構(gòu)。不對(duì)稱性突觸的突觸前末梢至少含有3個(gè)突觸性囊泡,前后膜平行,前后膜的間隙大,突觸后膜的PSD厚。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件,對(duì)CLSM和透射電鏡方法得到的樹突上V Glu T1位點(diǎn)分布比例進(jìn)行X2檢驗(yàn)分析。

結(jié) 果

1.LSCM觀察不對(duì)稱性突觸連接

應(yīng)用LSCM觀察CM-DiI和V Glu T1標(biāo)記的大鼠腦切片,可見CM-DiL標(biāo)記的大鼠紋狀體細(xì)胞中,有一部分細(xì)胞呈現(xiàn)中等棘刺神經(jīng)元的典型形態(tài)[5]。其胞體中等大小,直徑在15μm左右,胞體發(fā)出4-8支樹突,這些樹突可以再次分支;靠近胞體(20-30μm)的樹突表面光滑,沒有樹突棘;而在遠(yuǎn)離胞體的樹突上則有密集的樹突棘分布,據(jù)此特征可將中等棘刺神經(jīng)元與紋狀體膠質(zhì)細(xì)胞及其它類型神經(jīng)元相區(qū)分 (圖1.a)。

V Glu T1陽(yáng)性標(biāo)記部位呈點(diǎn)狀;V Glu T1陽(yáng)性位點(diǎn)很少分布于胞體近側(cè)的樹突上;在遠(yuǎn)離胞體的樹突上,V Glu T1陽(yáng)性標(biāo)記物大多分布于樹突棘上,而很少分布于樹突干上(圖1.b和圖1.c)。并且每個(gè)樹突棘上只有一個(gè)不對(duì)稱性突觸。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:在中等棘刺神經(jīng)元的樹突(共計(jì)數(shù)32段樹突)上,90.37%的V Glu T1陽(yáng)性位點(diǎn)分布于樹突棘上,9.63%的V Glu T1陽(yáng)性位點(diǎn)分布于樹突干上。

圖1 CM-DiI單細(xì)胞標(biāo)記中等棘刺神經(jīng)元結(jié)合VGlu T1免疫熒光染色,共聚焦顯微鏡層描疊加后的的圖像。(A)DiI標(biāo)記的單個(gè)紋狀體中等棘刺神經(jīng)元;標(biāo)尺為30μm。(B)V Glu T1陽(yáng)性位點(diǎn)(綠色)與一個(gè)中等棘刺神經(jīng)元的樹突棘相接觸。(E)V Glu T1陽(yáng)性位點(diǎn)(綠色)與一個(gè)中等棘刺神經(jīng)元的樹突干相接觸。圖中的虛線顯示的是 Y-Z視野(D和 F)和X-Z視野(C和 G)所在的位置;標(biāo)尺=5μm。Fig.1 Identification of sites of contacts between VGlu T1 positive punctuates and CM-DiIlabeled medium spiny neurons by CLSM.(A)CM-DiIlabeled medium spiny neurons.(Bar=30μm).(B)A VGlu T1 positive punctuates(green)makes contacts with a dendritic spine(red).(E)a VGlu T1 positive punctuates(green)makes contacts with a dendritic branch(red).The dotted lines in represent the position within the X-Y view at which the Y-Z view(D,F)and the X-Z view(C,G)were generated.(Bar=5μm)

2.TEM觀察不對(duì)稱性突觸連接

透射電鏡下觀察到,紋狀體內(nèi)有大量的對(duì)稱性和不對(duì)稱突觸。其中,不對(duì)稱性突觸的突觸前、后膜平行,突觸后致密帶厚而明顯(圖2);對(duì)稱性突觸的突觸前、后膜平行,但是突觸后致密帶不明顯,僅表現(xiàn)為突觸后膜的輕度增厚。據(jù)此特點(diǎn),兩種突觸可以很明顯地進(jìn)行區(qū)分。在本實(shí)驗(yàn)中,隨機(jī)選取了278個(gè)不對(duì)稱性突觸進(jìn)行分布特點(diǎn)觀察分析,結(jié)果顯示,93.53%的不對(duì)稱性突觸分布于樹突棘上,6.47%的不對(duì)稱性突觸分布于樹突干上,而且每個(gè)樹突棘上只有一個(gè)不對(duì)稱性突觸。此 TEM觀察結(jié)果與上述LSCM的觀察結(jié)果一致,即大鼠紋狀體神經(jīng)元的不對(duì)稱性突觸連接位點(diǎn)在樹突干和樹突棘上的分布比例相同。

圖2 正常大鼠紋狀體不對(duì)稱性突觸的透射電鏡觀察。標(biāo)尺 =0.5μm(A)顯示一個(gè)軸突與從樹突干b上伸出的樹突棘s形成不對(duì)稱性突觸(箭頭所示);(B)顯示兩個(gè)軸突與一個(gè)樹突干b形成兩個(gè)不對(duì)稱性突觸(箭頭所示);標(biāo)尺=0.5μm。Fig.2 Micrographs of electron microscopy showing asymmetric synapses in the striatum。White bar=5μm(A):an axon terminal makes a asymmetric synaptic contact(black arrow)onto a dendritic spine“s”which project from a dendrite branch“b”.(B):Two axon terminals make asymmetric synaptic contacts(black arrow)onto a dendrite branch“b”.(Bar=5 μm)

3.LSCM方法觀察谷氨酸能不對(duì)稱性突觸連接分布的特征

使用LSCM觀察CM-DiI和V Glu T1雙標(biāo)記的谷氨酸能不對(duì)稱性突觸連接位點(diǎn)并測(cè)量樹突段與胞體的距離后,可以繪制出V Glu T1陽(yáng)性突觸位點(diǎn)在樹突距胞體近側(cè)段和遠(yuǎn)側(cè)段的分布圖(圖3)。分布圖顯示:V Glu T1陽(yáng)性位點(diǎn)在中等棘刺神經(jīng)元樹突上的分布呈現(xiàn)出由低到高再到低(沿樹突近側(cè)→遠(yuǎn)側(cè)方向)的趨勢(shì)。這與以住應(yīng)用神經(jīng)束路示蹤方法得到的結(jié)果相類似[6]。

圖3 VGlu T1陽(yáng)性位點(diǎn)在中等棘刺神經(jīng)元樹突上的分布統(tǒng)計(jì)圖Fig.3 The distributions of V Glu T1 positive punctates making contact with the dendrites of medium spiny neurons.

討 論

當(dāng)前,TEM是考察中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸連接的最常用方法[6-9]。但這一方法對(duì)組織處理有特殊要求;并且在電鏡樣品中標(biāo)記突觸前、后神經(jīng)元不僅費(fèi)時(shí)且不經(jīng)濟(jì)有效。因此TEM往往只用作突觸連接的定性研究,也很難實(shí)現(xiàn)對(duì)突觸前末梢在突觸后神經(jīng)元上的空間分布進(jìn)行定量考察[7,9]。而這些信息對(duì)于了解神經(jīng)元上突觸信號(hào)的整合又極為重要。本研究中,我們應(yīng)用CM-DiI單細(xì)胞標(biāo)記中等棘刺神經(jīng)元。CM-DiI是脂溶性熒光染料DiI的一種衍生物可在細(xì)胞膜上擴(kuò)散,因此可以被清楚地顯示出細(xì)胞的輪廓。并且,經(jīng)甲醛固定后CM-DiI可以抵抗去污劑 Tween-20(用 Tween-20進(jìn)行細(xì)胞膜打孔時(shí)CM-DiI不會(huì)在細(xì)胞膜間擴(kuò)散),所以CM-DiI標(biāo)記樣品還可以進(jìn)行免疫熒光染色。V Glu T1(Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體)是皮質(zhì)紋狀體谷氨酸能纖維末梢的標(biāo)記物[4,7]。我們應(yīng)用 CM-Dil和V Glu T1分別標(biāo)記紋狀體內(nèi)的中等棘刺神經(jīng)元和谷氨酸能纖維末梢,實(shí)現(xiàn)對(duì)觀察樣品中突觸前、后神經(jīng)元的標(biāo)記。

以住研究發(fā)現(xiàn),來(lái)自于大腦皮質(zhì)的谷氨酸能神經(jīng)纖維投射至紋狀體中等棘刺神經(jīng)元,形成不對(duì)稱性突觸;γ-氨基丁酸和多巴胺等其它遞質(zhì)類型的投射纖維則形成對(duì)稱性突觸[1-5]。所以,分布在紋狀體神經(jīng)元上的不對(duì)稱性突觸中的突觸前末梢即是谷氨酸能纖維末梢。本研究中,CLSM和 TEM觀察結(jié)果均顯示每個(gè)樹突棘上通常都只有一個(gè)不對(duì)稱性突觸。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示:V Glu T1陽(yáng)性位點(diǎn)在樹突干和樹突棘上的分布比例與不對(duì)稱性突觸在樹突干和樹突棘上的分布比例,二者沒有顯著性差異(P>0.05)。綜上所述說明,1)LSCM觀察到的V Glu T1陽(yáng)性位點(diǎn)與中等棘刺神經(jīng)元的接觸位點(diǎn)即是谷氨酸能突觸所在;2)LSCM方法可以有效地用于觀察谷氨酸能纖維末梢與紋狀體神經(jīng)元樹突的突觸連接。

另外,本研究發(fā)現(xiàn)V Glu T1陽(yáng)性位點(diǎn)在中等棘刺神經(jīng)元樹突上的分布呈現(xiàn)由低到高再到低(從樹突近側(cè)→遠(yuǎn)側(cè))的趨勢(shì),這與以住應(yīng)用逆行束路追蹤和免疫熒光組織化學(xué)雙標(biāo)技術(shù)研究結(jié)果相一致[6]。這說明,LSCM方法不僅是一種有效地觀察谷氨酸能纖維末梢在中等棘刺神經(jīng)元上的空間分布簡(jiǎn)易方法,并且也可用于突觸空間分布定量研究。與普通光鏡相比,CLSM不僅分辨率高,而且可在三維重建后從X-Y,Y-Z和X-Z三個(gè)視野觀察突觸前末梢和突觸后神經(jīng)元是否真正連接,從而排除了普通光鏡下突觸前末梢和突觸后神經(jīng)元假陽(yáng)性連接被計(jì)數(shù)的情況[9]。與 TEM方法相比,CLSM方法所需的組織處理,切片染色等環(huán)節(jié)步驟簡(jiǎn)易,并可實(shí)現(xiàn)對(duì)突觸前末梢、突觸后神經(jīng)元的雙標(biāo)記,因而可以實(shí)現(xiàn)對(duì)突觸的分布情況的進(jìn)行空間定量觀察。所以,CLSM方法填補(bǔ)了普通光鏡和電鏡之間的空缺。此外,在CLSM方法中可利用多重?zé)晒鈽?biāo)記不同種類的突觸前末梢,從而可以同時(shí)觀察多種突觸在同一神經(jīng)元空間分布特點(diǎn),為全面理解神經(jīng)元信息分析整合機(jī)制奠定形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。

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Comparative study on glutamatergic synaptic connections in rat str iatum with laser scanning confocal microscopy and electron microscopy

Cai Qing,Ji Man,Zhang Jinlu＊,Zhao Junpeng＊
(Medical Center f or Ex periment and Test,Capital Medical University,Beijing 100069,China)

Objective To evaluate the advantage of the use of laser scanning confocal microscopy(LSCM)for observing the glutamatergic striatal synaptic connections in comparison with the observation with transmission electron microscopy(TEM).Methods 12 normal adult rats were divided into two groups:6 ratsfor LSCM or TEM each.With CM-DiIand V Glu T1 immunofluorescence labeling,the distribution of the asymmetrical glutamatergic synaptic connections on the dendrites of striatal neurons was observed,and 3-D reconstruction was done.The 6 rats were studied with TEM.Results There is no significant difference in the distribution characters of the glutamatergic striatal synaptic connections obtained with either LSCM or TEM.However,the whole view of the synapses and dendrites and the three-dimensional reconstruction of synaptic connections between neurons can be obtained with LSCM but not TEM.Conclusion LSCM is an effective and quantitative technique to investigate the glutamate synaptic connections of striatal neurons.

Confocal laser microscopy; Transmission electron microscopy; Immunofluorescence staining; Synaptic connections

R322.811

A

10.3870/zgzzhx.2011.03.007

2011-01-14

2011-03-31

北京市自然基金資助項(xiàng)目資助(7062008)

蔡青,女(1960年),漢族,實(shí)驗(yàn)師。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)