羅 勛 王 云 王春花 王順昌

貓下丘中央核5-HT、P物質(zhì)和星形膠質(zhì)細(xì)胞年齡相關(guān)變化

羅 勛＊王 云 王春花 王順昌

(淮南師范學(xué)院生命科學(xué)系,安徽232001)

目的 比較研究青年貓與老年貓下丘中央核(CIC)5-羥色氨(5-HT)、P物質(zhì)(SP)能神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞年齡性變化,探索老年個(gè)體聽力下降的神經(jīng)機(jī)制。方法 Nissl染色顯示下丘神經(jīng)元,免疫組織化學(xué)ABC法顯示5-HT、SP和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫反應(yīng)(immunoreactive,IR)細(xì)胞。光鏡下觀察、拍照,對(duì)神經(jīng)元和5-HT、SP及 GFAP免疫反應(yīng)細(xì)胞分別計(jì)數(shù)并換算成密度,測(cè)量其 IR細(xì)胞直徑取平均值,以及它們的陽性反應(yīng)平均灰度值。結(jié)果 5-HT-IR、SP-IR和GFAP-IR細(xì)胞、陽性纖維及其終末在青年貓及老年貓下丘中央核均有分布。與青年貓相比,老年貓下丘中央核5-HT密度均顯著下降(P<0.01),胞體直徑明顯減小(P<0.01),陽性反應(yīng)明顯減弱(陽性反應(yīng)強(qiáng)度與灰度值呈負(fù)相關(guān)),SP-IR神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞密度卻顯著增大,陽性反應(yīng)顯著增強(qiáng)。結(jié)論 在衰老過程中貓下丘神經(jīng)元尤其是5-HT能神經(jīng)元有顯著丟失現(xiàn)象,提示5-HT能神經(jīng)元顯著減少導(dǎo)致下丘聽覺信息傳遞功能減弱,可能引起老年個(gè)體聽覺功能衰退的重要原因;SP能神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞密度顯著增大,可能起到延緩衰老的作用。

貓; 下丘中央核; 5-HT; P物質(zhì); 星形膠質(zhì)細(xì)胞

腦干聽覺中樞-下丘是皮層下聽覺信息加工處理的重要中繼站,分布著極為豐富的神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,且豐富的神經(jīng)元能合成和分泌多種遞質(zhì),如5-羥色氨(5-HT)和 P物質(zhì)(substance P,SP),對(duì)聽覺信息的傳遞和加工有重要作用。在衰老過程中,下丘組織結(jié)構(gòu)的改變可能導(dǎo)致聽覺功能衰退。已有大量研究表明,下丘 GABA能神經(jīng)元顯著丟失及其功能異?？蓪?dǎo)致老年性個(gè)體嚴(yán)重聽覺障礙[1-4]。但對(duì)下丘5-HT、SP和星形膠質(zhì)細(xì)胞尚少見明確報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過定量比較,研究了青年貓與老年貓下丘中央核5-HT、P物質(zhì)和星形膠質(zhì)細(xì)胞年齡相關(guān)形態(tài)學(xué)變化,以期為聽覺功能衰退的神經(jīng)機(jī)制積累形態(tài)學(xué)資料。

材料和方法

1.材料及組織準(zhǔn)備

選用經(jīng)聽覺檢查(耳蝸反射)無聽覺缺陷的青年貓(1-3齡,體重 2-2.5kg)和老年貓(11-13齡,體重3.0-3.5kg)各4只,鹽酸氯胺酮(40mg/kg體重)深度麻醉,開胸后經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈,灌注0.9%的生理鹽水,至肝臟發(fā)白后灌注含4%多聚甲醛和2.5%戊二醛的0.1mol/L磷酸緩沖液(200ml/kg體重)進(jìn)行預(yù)固定,開顱取出下丘,移入4%多聚甲醛中固定20-24h,PBS(0.1mol/L,p H7.4)沖洗,常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋,作厚6 m的連續(xù)冠狀切片,裱片于APES處理的載玻片上,每隔10張切片取1張切片用于Nissl染色、相鄰切片用于免疫組織化學(xué)染色及陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

2.神經(jīng)元Nissl染色

Nissl染色采用0.5%焦油紫染色。

3.免疫組織化學(xué)染色

石蠟切片脫蠟至水,3%H2O2室溫孵育5min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性;蒸餾水沖洗,PBS浸泡5min;滴加正常山羊血清,室溫孵育10min,封閉非特異性反應(yīng)部位;傾去血清,勿洗,滴加一抗(兔抗人5-HT多克隆抗體:稀釋比1:200),37℃孵育1h;PBS沖洗5min×3;滴加生物素標(biāo)記二抗(羊抗兔Ig G抗血清),37℃孵育10min;PBS沖洗5min×3;滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素過氧化物酶工作液—三抗(ABC),37℃孵育10min,PBS沖洗5min×3;DAB顯色,自來水沖洗,脫水,透明,封片。陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)采用正常山羊血清代替一抗,其余步驟同上。P物質(zhì)(稀釋比 1:200)和 GFAP(稀釋比 1:200)多克隆抗體染色方法同5-HT多克隆抗體。

實(shí)驗(yàn)所用5-HT、P物質(zhì)和 GFAP兔抗人血清及配套的免疫組織化學(xué)SP試劑盒、DAB購于美國Labvision公司。

4.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

染色后的切片在Olympus BX-51型熒光顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)、測(cè)量、拍照,Nissl染色計(jì)神經(jīng)元密度,免疫組織化學(xué)染色計(jì)5-HT、P物質(zhì)能神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞密度及其直徑。隨機(jī)選取20張切片,每張切片在光鏡(×200)下取 5個(gè)視野,利用 Image-Pro Express 5.1圖像分析軟件測(cè)量視野內(nèi)5-HT陽性細(xì)胞、P物質(zhì)陽性細(xì)胞和 GFAP陽性細(xì)胞密度;測(cè)量視野內(nèi)5-HT陽性細(xì)胞、P物質(zhì)陽性細(xì)胞和 GFAP陽性細(xì)胞直徑,取平均值(μm);測(cè)量視野內(nèi)5-HT、P物質(zhì)和 GFAP陽性反應(yīng)灰度,取平均值。所有數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±SD)表示,用t-test進(jìn)行各指標(biāo)的顯著性檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1.神經(jīng)元(Nissl染色)

下丘中央核神經(jīng)元形態(tài)、大小不盡相同,有圓形、錐體形、卵圓形、三角形或多極形。胞體及樹突為藍(lán)色,其中以圓形較小的顆粒細(xì)胞為主(圖1,2)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,老年貓下丘中央核神經(jīng)元平均密度較青年貓的下降12.88%(見附表)[5]。

2.5 -HT、P物質(zhì)和GFAP(免疫組織化學(xué)染色)

下丘中央核5-HT、P物質(zhì)陽性反應(yīng)神經(jīng)元分布均勻,胞體呈棕黃色,多為中等大小的圓形或橢圓形細(xì)胞,小部分為形態(tài)較大的圓形、橢圓形及多極形細(xì)胞(圖3,4,5,6)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示青年貓5-HT、P物質(zhì)能神經(jīng)元占神經(jīng)元總數(shù)的比例為20.43%、35.32%,老年個(gè)體的比例為17.08%、46.86%。老年貓下丘中央核5-HT陽性神經(jīng)元密度較青年貓的下降了27.18%,P物質(zhì)陽性神經(jīng)元密度較青年貓的增加了13.47%(見表1)。老年貓5-HT胞體直徑較青年貓的減小了2.07μm;青年貓與老年貓的SP胞體直徑無顯著性差異(見表1)。老年貓星形膠質(zhì)細(xì)胞密度和直徑分別增加了41.48%、1.00μm(見表1)。此外,老年貓5-HT能神經(jīng)元與神經(jīng)元數(shù)的比例較青年貓下降了3.35%,P物質(zhì)能神經(jīng)元與神經(jīng)元數(shù)的比例較青年貓的增加了11.54%,以及老年貓5-HT陽性反應(yīng)神經(jīng)元灰度值顯著增大及P物質(zhì)能神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞灰度值明顯減小(見表2)。t檢驗(yàn)表明,老年貓下丘中央核5-HT能神經(jīng)元數(shù)目顯著減少及 P物質(zhì)能神經(jīng)元數(shù)目則明顯增加(P<0.01)(見表1);5-HT陽性神經(jīng)元胞體平均直徑明顯減小(P<0.01)(見表1);5-HT灰度值顯著增大(P<0.01),P物質(zhì)和星形膠質(zhì)細(xì)胞陽性反應(yīng)灰度值明顯減小 (P<0.01)(見表2)。

表1 青年貓和老年貓下丘中央核神經(jīng)元和5-HT、P物質(zhì)能神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞比較(ˉx±s)Table 1 A comparison on density and diameter of neurons and 5-HT,SPergic cells,and astrocytes in th ecenter of inferior colliculus of young and old cat(ˉx ±s)

表2 青年貓和老年貓下丘中央核神經(jīng)元和5-HT、P物質(zhì)、GFAP免疫陽性反應(yīng)細(xì)胞平均灰度值比較(ˉx±s)Table 2 A comparison on average gray value of 5-HT,SP,and GFAPimmunoreactive cells in the center of inferior colliculus of young and old cats(ˉx ±s)

討 論

下丘是皮層下聽覺信息加工的重要中樞,在聽覺神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)、聲源的定位以及音頻和音色的辨別等聽覺信息處理過程中起重要作用[6]。下丘核分為中央核、外核和背核三個(gè)亞部,中央核為聽覺核心投射的重要中繼核團(tuán),主要功能是處理聽覺信息[7]。

1.5 -羥色胺 (5-hydroxytryptamine,5-HT),又稱血清素(serotonin),是人體重要的活性物質(zhì),以色氨酸(tryptophan,Trp)為原料,首先在色氨酸羥化酶(tryptophanhydroxylase,TPH)作用下合成5-羥色胺酸,再在 5-羥色胺酸脫竣酶(5-hydrotryptophen decarboxylase,5-HTPDC)作用下將5-羥色氨酸合成5-HT。5-羥色胺是一種在生物體內(nèi)以神經(jīng)遞質(zhì)的形式存在的一元胺,可以從行為和內(nèi)分泌兩方面減小生物對(duì)外環(huán)境或生物自身生理變化的反應(yīng),調(diào)控生物體的情緒變化、體溫等。5-羥色胺缺乏會(huì)引起一系列的生理機(jī)能紊亂,在無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物的研究中都表明,5-羥色胺合成于一系列神經(jīng)元中,這些神經(jīng)元有多樣化的突觸功能和突觸連接,在感覺信號(hào)的刺激下,5-羥色胺信號(hào)放大,達(dá)到抑制突觸易化和行為感受性的目的。已有研究顯示,秀麗線蟲5-羥色胺能神經(jīng)系統(tǒng)缺陷能夠引起感覺信號(hào)整合能力的下降;外源施加5-羥色胺可部分恢復(fù)5-羥色胺能神經(jīng)系統(tǒng)缺陷引起的感覺信號(hào)整合能力的下降,對(duì)于轉(zhuǎn)運(yùn)再攝取與受體功能缺陷引起的下降卻無法恢復(fù)[8]。目前研究表明,5-HT耗竭大鼠應(yīng)激時(shí)更容易產(chǎn)生抑郁和焦慮癥狀,并易導(dǎo)致學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能受損,對(duì)應(yīng)激適應(yīng)能力下降[9]。5-HT作為一種抑制性的神經(jīng)遞質(zhì)[10-13],在下丘中廣泛存在,對(duì)傳入的聽覺信息發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。本研究發(fā)現(xiàn),5-HT在下丘中央核亦呈顯著的年齡性變化,即老年個(gè)體顯著減少。免疫組化研究發(fā)現(xiàn),5-HT陽性纖維和終末與 GABA胞能神經(jīng)元的胞體密切接觸[14]。結(jié)合生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),下丘中央核GABA能抑制性相對(duì)減弱可導(dǎo)致其聽空間反應(yīng)閾擴(kuò)大、方向敏感性下降,提示5-HT與 GABA對(duì)傳遞的信息起到共同的抑制作用,推測(cè)老年個(gè)體下丘中央核5-HT下降亦可能是聽覺功能減退的一個(gè)重要原因。

2.SP是一種神經(jīng)肽,是一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì),廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng),在一些DRG(dorsal root ganglia)神經(jīng)元的核周質(zhì)及神經(jīng)元到脊髓背根的神經(jīng)傳導(dǎo)通路上有很高的含量[15]。近年來研究表明,SP是一種肽能遞質(zhì),是感覺神經(jīng)的傳導(dǎo)物質(zhì),也是感覺神經(jīng)元生長、發(fā)育、成熟的標(biāo)志,含SP的感覺性神經(jīng)末梢具有雙向傳導(dǎo)功能,在向中樞傳遞受刺激信息時(shí)起遞質(zhì)作用,在局部釋放 SP及其它肽類物質(zhì)時(shí)起調(diào)質(zhì)作用。SP既是初級(jí)感覺神經(jīng)元的神經(jīng)遞質(zhì),又是中樞感覺神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì),參與聽覺信息的傳遞。已有研究發(fā)現(xiàn),SP能影響不同類型靶細(xì)胞的增殖,在皮膚損傷時(shí)期,SP參與局部炎癥反應(yīng)及免疫反應(yīng),可促進(jìn)創(chuàng)面的修復(fù)[16]。本實(shí)驗(yàn)觀察顯示,老年貓下丘中央核SP含量明顯增加,表明在衰老過程中,SP對(duì)神經(jīng)元的損傷有修復(fù)作用,同時(shí)SP作為興奮性遞質(zhì),其含量顯著提高,結(jié)合已有研究顯示 GABA抑制性性遞質(zhì)的顯著下降[5],提示興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之間的平衡被打破,聽覺信息的正常調(diào)制及傳輸受到影響。

3.膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)作為星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte,AS)特異性標(biāo)志蛋白,可作為星形膠質(zhì)細(xì)胞分化和功能活性的指標(biāo)。星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)中起支持、營養(yǎng)、代謝、合成、分泌、維持離子平衡等多種重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn),貓?jiān)谒ダ线^程中AI區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活動(dòng)增強(qiáng)[17]。本研究結(jié)果與其一致,顯示老年貓下丘中央核星形膠質(zhì)細(xì)胞密度和直徑均顯著增大。膠質(zhì)細(xì)胞活動(dòng)增強(qiáng)可能對(duì)衰老中下丘具有保護(hù)作用:填充神經(jīng)元凋亡所產(chǎn)生的基質(zhì)空缺,維持老年下丘的形態(tài);通過形成的血管周足吸收血液中的營養(yǎng)物質(zhì),為下丘提供大量營養(yǎng),并穩(wěn)定衰老中神經(jīng)元周圍的微環(huán)境,維持其正常的生理功能,延緩下丘進(jìn)一步衰老。

總之,在衰老過程中,貓下丘中央核5-HT、SP、星形膠質(zhì)細(xì)胞,呈現(xiàn)顯著的年齡相關(guān)性變化,可能是導(dǎo)致老年個(gè)體聽力下降的重要原因。但本文僅僅比較分析了三者的變化及可能的生理作用,可導(dǎo)致其發(fā)生變化的原因,以及它們之間的作用機(jī)制等相關(guān)因素都有待進(jìn)一步探討。

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圖 版 說 明

圖1 Nissl染色示青年貓下丘中央核神經(jīng)元?！?00

圖2 Nissl染色示老年貓下丘中央核神經(jīng)元?！?00

圖3 5-HT免疫組織化學(xué)反應(yīng)示青年貓下丘中央核5-HT陽性反應(yīng)神經(jīng)元,5-HT陽性反應(yīng)神經(jīng)元(→)?！?00

圖4 5-HT免疫組織化學(xué)反應(yīng)示老年貓下丘中央核5-HT陽性反應(yīng)神經(jīng)元,5-HT陽性反應(yīng)神經(jīng)元(→)?！?00

圖5 SP免疫組織化學(xué)反應(yīng)示青年貓下丘中央核SP陽性反應(yīng)神經(jīng)元,SP陽性反應(yīng)神經(jīng)元(→)?！?00

圖6 SP免疫組織化學(xué)反應(yīng)示青年貓下丘中央核 GABAergic能神經(jīng)元,SP陽性反應(yīng)神經(jīng)元(→)?！?00

圖7 GFAP免疫組織化學(xué)反應(yīng)示青年貓下丘中央核星形角質(zhì)細(xì)胞,星形膠質(zhì)細(xì)胞→)?！?00

圖8 GFAP免疫組織化學(xué)反應(yīng)示老年貓下丘中央核星形角質(zhì)細(xì)胞,星形角質(zhì)細(xì)胞(→)?！?00

EXPLANATIONOF FIGURES

Fig.1 Nissl staining to show neurons in the CIC of young cat.×200

Fig.2 Nissl staining to shows neurons in the CICof old cat.×200

Fig.3 5-HT immunoreaction to show 5-HT ergic cells in the CICof young cat,5-HT ergic cells(→). ×200

Fig.4 5-HT immunoreaction to show 5-HT ergic cells in the CICof old cat,5-HT ergic cells(→). ×200

Fig.5 SPimmunoreaction to show SPergic cells in the CICof young cat,SPergic cells(→). ×200

Fig.6 SPimmunoreaction to show SPergic cells in the CICof young cat,SPergic cells(→). ×200

Fig.7 GFAPimmunoreaction to show astrocytes in the CIC of young cat,astrocytes(→). ×200

Fig.8 GFAPimmunoreaction to show astrocytes in the CIC of old cat,astrocytes(→). ×200

Age-related changes of 5-HT,substance P,and astrocytes in infer ior colliculus center of cats

Luo Xun＊,Wang Yun,Wang Chunhua,Wang Shunchang
(Department of Lif e Science,Huainan Normal University,Anhui 232001,China)

Objective Age-related changes of 5-HT,SP,and astrocytes in the inferior colliculus of young adult and old cats were investigated comparatively,and the neural mechanism of the auditory degeneration during senescence underlying these changes was discussed.Methods Nissl staining was used to display all the inferior colliculus neurons,and immunohistochemical method was used to exhibit 5-HT immunoreactive(5-HT-IR)cells,substance Pimmunoreactive(SP-IR)cells,and astrocytes.Under the microscope,the number of the 5-HT-IR cells,SP-IR cells and astrocytes was counted,and their diameter and density were measured.Results The 5-HT-IR cells,SP-IR cells,astrocytes,fibers and their teminals were distributed widely in central neucli of inferior colliculus in young and old cats.The diameter and density of 5-HT-IR ergic neurons declined,while grey value significantly increased in the old cats when compared with those of the young adults.But SP-IR cells and astrocytes were on the contrary.Conclusion An evident loss of the 5-HT-IR neurons in old inferior colliculus may result in an imbalance of excitement and inhibition,which might be an important reason for the auditory degeneration in senescence.The f unctional increase of SPand astrocytes may delay aging.

Cat; Central of inferior colliculus(CIC); 5-hydroxytryptamine(5-HT);Substance P(SP); Astrocyte

R322.811

A

10.3870/zgzzhx.2011.03.002

2011-01-14

2011-04-02

國家自然科學(xué)基金資助(20907016;21077040);安徽省自然科學(xué)基金資助(090413257);安徽省高等學(xué)校自然科學(xué)基金資助(ZD200909;KJ 2009B156)

羅勛,男(1972年),漢族,碩士,講師。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)