吳義春 吳 強 楊 雁 楊 楓 陳敏珠
肝組織中 NF-κB、TGF-β1及其 Ⅰ型受體 mRNA和 HSC在肝纖維化中的改變及護肝片對其的影響
吳義春*吳 強*1楊 雁1楊 楓1陳敏珠1
(安徽醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校病理學(xué)教研室合肥230601;1安徽醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室合肥230022)
目的 探討中、晚期纖維化大鼠肝組織中肝星狀細(xì)胞(HSC)的活化與增殖、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)及轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)及其Ⅰ型受體(TβRⅠ)表達(dá)的改變及護肝片對其的影響。方法 采用12.5%CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型,自造模之日起,大鼠分組灌胃給藥(護肝片921mg/kg)或溶媒,每日一次,直至8或13周末,分別處死動物,取左葉肝組織石蠟包埋,制作組織芯片。免疫組化S-P法檢測大鼠肝組織α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和NF-κB p65蛋白的表達(dá),原位雜交檢測 TGF-β1及 TβRⅠmRNA的表達(dá);并用MetaMorph圖像分析系統(tǒng)計數(shù)α-SMA陽性細(xì)胞數(shù),對NF-κB p65蛋白、TGF-β1及TβRⅠmRNA的表達(dá)量進行定量分析。結(jié)果 1.模型復(fù)制8周和13周,模型組的肝損傷及其纖維化分級均明顯高于正常組(P<0.01),護肝片組的肝損傷及其纖維化分級均輕于模型組。2.模型復(fù)制8周和13周,模型組活化的 HSC(即α-SMA陽性細(xì)胞)數(shù)量較正常組明顯增多,NF-κB p65蛋白、TGF-β1及 TβRⅠmRNA的表達(dá)均較正常組明顯增強(P<0.01);3.護肝片顯著抑制8、13周纖維化肝組織 HSC的活化與增殖和NF-κB p65蛋白、TGF-β1及 TβRⅠmRNA的表達(dá)(P<0.01)。結(jié)論 抑制 HSC的活化與增殖和NF-κB p65蛋白與 TGF-β1及 TβRⅠmRNA的表達(dá)可能是護肝片抗肝纖維化作用的靶點之一。
肝纖維化; 護肝片; 肝星狀細(xì)胞; 核轉(zhuǎn)錄因子-κB; 轉(zhuǎn)化生長因子-β1; 轉(zhuǎn)化生長因子-βRⅠ;免疫組化; 原位雜交; 組織芯片
肝纖維化是肝臟受到慢性損傷時的一種修復(fù)反應(yīng),是慢性肝病發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)階段,其主要特征是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的合成與降解失衡,導(dǎo)致ECM在竇周間隙的大量沉積。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSC)是肝纖維化時ECM過多產(chǎn)生和沉積的主要細(xì)胞來源,HSC的激活、增殖及 ECM的過量沉積在肝纖維化過程中起核心作用[1,2]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor κB,NF-κB)是一種具有轉(zhuǎn)錄激活功能的蛋白質(zhì),普遍存在于多種組織的多種細(xì)胞中。體外研究發(fā)現(xiàn)NF-κB可能參與調(diào)控了肝纖維化過程中的枯否氏細(xì)胞(Kupffer cells,KC)和肝星狀細(xì)胞的活化[3-4]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-beta 1,TGF-β1)是強有力的致纖維化的細(xì)胞因子,促進HSC增殖活化,在纖維化進程中起重要作用[5]。護肝片抑制纖維化肝組織 TGF-β1及 TβRⅠ蛋白的表達(dá)[2],為此,本研究擬就護肝片對中晚期纖維化大鼠肝組織 HSC與 NF-κB、TGF-β1及 TβR ⅠmRNA 表達(dá)的影響進行觀察,進一步探討其抗肝纖維化作用機制。
1.動物模型的建立和肝組織的處理
SD大鼠54只,雌雄兼用,體重150-180g,由上海西普爾-必凱實驗動物中心提供(清潔級),標(biāo)準(zhǔn)飼料,自由飲水。隨機分成兩大組:模型復(fù)制8與13周,均各設(shè)正常組、模型組和護肝片(921mg/kg)組。自模型復(fù)制之日起,除正常組外,各組大鼠按100g體重0.5ml背部皮下注射10﹪CCl4精制花生油溶液,每周2次[6],分別連續(xù)8與13周。灌胃(ig)給藥,每天1次,正常組與模型組ig等容量5g/l羥甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液,直至8周或13周。分別在實驗的第8、13周末處死動物,取左葉肝組織常規(guī)10﹪甲醛溶液固定,石蠟包埋,4μm連續(xù)切片,HE染色,光鏡觀察。
2.組織芯片制作
HE染色切片在光鏡下用定位器定位后,通過打孔、定位、取樣、點樣,從供體蠟塊中的相應(yīng)部位采集目標(biāo)組織整齊包埋于受體蠟塊中,制成組織片直徑為1mm、間隔1mm的組織芯片。4μm連續(xù)切片,貼附于經(jīng)10﹪多聚賴氨酸防脫片預(yù)處理的載玻片上,分別作蘇木精-伊紅(HE)染色、網(wǎng)狀纖維染色、Van Gieson(V G)膠原纖維染色、免疫組織化學(xué)染色和原位分子雜交。
3.免疫組化 S-P法檢測α-SMA、NF-κB蛋白的表達(dá)
采用檸檬酸鈉緩沖液熱抗原修復(fù),S-P法免疫組織化學(xué)染色,用DAB/H202顯色,蘇木精復(fù)染。羊抗Actin(Ⅰ-19)、兔抗 NF-κB p65多克隆抗體均購于Santa Cruz,兔S-P法(Second Generation LABSA)Kits試劑盒為美國Zymed公司產(chǎn)品。具體操作遵試劑盒說明書,用已知陽性切片作為陽性對照,用PBS代替一抗作為陰性對照。
4.原位雜交檢測 TGF-β1及 TβRⅠmRNA 的表達(dá)
TGF-β1及 TβRⅠ的寡核苷酸探針均經(jīng)地高辛標(biāo)記,顯色系統(tǒng)為生物素化鼠抗地高辛和過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素(SABC),DAB顯色。針對TGF-β1靶基因的 mRNA 的探針序列為:(1)5′-ACCTG CAA GA CTA TC GACA T GGA GC TGGTG-3′;(2)5′-TGTAC AACA G CACCC GCGAC CGGGT GGCCG-3′;(3)5′-GTACC A GAAA TACA G CAACA A TTCC TGGCG-3′。針對 TβRⅠ靶基因的 mRNA的探針序列為:(1)5′-TA GCT GAAA T TGACT TAA TT CCTCG A GA TA-3′;(2)5′-GTGTC A GA TT A TCA T GA GCA TGGA T CCCTT-3′;(3)5′-GTA TGCCAA T GGA GC A GCTA GGCTT ACA GC-3′。TGF-β1及 TβR Ⅰ的原位雜交檢測試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。具體操作遵試劑盒說明書,用已知陽性切片作為陽性對照,用預(yù)雜交液代替雜交液作陰性對照。
5.定量分析
肝纖維化病理學(xué)分級為0-Ⅵ級[7]。α-SMA免疫組化染色以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性,200倍光鏡下任選3個250μm×250μm范圍計數(shù)α-SMA陽性細(xì)胞來判斷結(jié)果。NF-κB以細(xì)胞漿和∕或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性;TGF-β1及 TβRⅠmRNA 的原位雜交染色結(jié)果,以胞漿內(nèi)或胞膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。Eclip se E800型光學(xué)顯微鏡(日本Nikon)(×400)下任選取3個視野用Spot Advanced顯微攝像系統(tǒng)(美國Diagnostic Instruments Inc)拍攝照片,用 4.01版MetaMorp h圖像分析系統(tǒng)(美國Universal Imaging公司)進行顯微定量分析,分析每個組織片上NF-κB 蛋白、TGF-β1及 TβR ⅠmRNA 的平均灰度值(Average gray value,A GV)和平均光密度值(Mean optical density,MOD)。
6.統(tǒng)計學(xué)處理
運用SPSS(11.0 for windows)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料間比較采用t檢驗和one way ANOVA檢驗。
1.護肝片對CCl4性纖維化大鼠肝臟病理學(xué)改變的影響
HE、網(wǎng)狀纖維及V G膠原纖維染色結(jié)果見表1。正常組肝小葉結(jié)構(gòu)完整,肝細(xì)胞排列整齊,無炎細(xì)胞浸潤,模型組大鼠在模型復(fù)制8、13周均可見肝細(xì)胞脂肪變性、水變性和點狀壞死、碎片狀壞死,13周時膠原纖維增生形成完整的纖維間隔,并分割肝小葉形成假小葉,纖維間隔內(nèi)可見慢性炎細(xì)胞浸潤。在模型復(fù)制8、13周,護肝片組肝細(xì)胞的水變性、脂肪變性、炎細(xì)胞浸潤及纖維組織增生均輕于模型組。模型復(fù)制8、13周,正常組與模型組肝纖維化分級比較,差異有顯著性(P<0.01)。
表1 大鼠CCl4性肝纖維化8、13周的病理學(xué)分級(單位:只)Table 1 Fibrosis grades of carbon tetrachloride-induced fibrotic liver in rats during 8 and 13 weeks(unit:number)
2.α-SMA陽性細(xì)胞在正常及纖維化大鼠肝組織中的分布及護肝片對其數(shù)量的影響
HE染色結(jié)合免疫組化染色結(jié)果觀察顯示,α-SMA陽性細(xì)胞位于竇周Disse間隙,形態(tài)不規(guī)則,胞體呈卵圓形或不規(guī)則。正常組、模型組及護肝片組肝組織中均有α-SMA陽性細(xì)胞,但其數(shù)量明顯的不同(表2)。大鼠CCl4性肝纖維化8周、13周,模型組α-SMA陽性細(xì)胞數(shù)均明顯高于正常組,且模型組的α-SMA陽性細(xì)胞數(shù)8周明顯高于13周。大鼠CCl4性肝纖維化 8周、13周,護肝片組肝組織α-SMA陽性細(xì)胞數(shù)量均顯著低于模型組。
3.NF-κB p65蛋白在 CCl4性纖維化大鼠肝臟組織和細(xì)胞中的分布及護肝片對其表達(dá)的影響
正常對照組大鼠肝組織較少表達(dá)NF-κB p65蛋白(圖1,圖4),模型組大鼠肝組織則有較強的NF-κB p65蛋白表達(dá),分布在細(xì)胞漿、細(xì)胞核中(圖2,圖5)。NF-κB p65蛋白的陽性染色分布于纖維化區(qū)、肝竇壁、血管壁及部分膽管細(xì)胞,脂肪變性和水變性的肝細(xì)胞也可見陽性染色。表3顯示,大鼠CCl4性肝纖維化8、13周,模型組肝組織NF-κB p65蛋白的表達(dá)量顯著高于正常組。模型組肝組織NF-κB p65蛋白的表達(dá)量8、13周相比差異無顯著性。大鼠CCl4性肝纖維化8、13周,護肝片(圖3,圖6)顯著地抑制纖維化肝組織 NF-κB p65蛋白的表達(dá)(P<0.01)。
表2 護肝片對CCl4所致纖維化大鼠肝組織α-SMA陽性細(xì)胞數(shù)量的影響(單位:個)Table 2 Effect of Liver-aid tablets on the number of α-SMA positive cells in carbon tetrachloride-induced fibrotic liver tissue(unit:number)
表3 護肝片對CCl4所致纖維化大鼠肝組織NF-κB p65蛋白表達(dá)量的影響Table 3 Effect of Liver-Aid tablets on expression of NF-κB p65 protein in carbon tetrachloride-induced hepatofibrotic rats
4.TGF-β1及 TβR Ⅰ的 mRNA 在 CCl4性纖維化大鼠肝臟組織和細(xì)胞中的分布及護肝片對其的影響 正常肝組織不表達(dá)或僅微弱表達(dá) TGF-β1及TβRⅠmRNA,它們分布于胞質(zhì)和∕或胞核內(nèi)(圖7,圖 10,圖 13,圖 16);模型組 (圖 8,圖 11,圖 14,圖17)和護肝片(圖 9,圖 12,圖 15,圖 18)組肝組織均有較強的 TGF-β1及 TβRⅠmRNA 表達(dá),主要分布在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核上。TGF-β1及 TβRⅠmRNA的陽性染色分布于變性的肝細(xì)胞、纖維化區(qū)、肝竇壁、血管壁及部分膽管細(xì)胞。表4顯示,大鼠CCl4性肝纖維化8周、13周,模型組肝組織 TGF-β1及 TβRⅠmRNA的表達(dá)量均顯著高于正常組。模型組肝組織,TGF-β1mRNA的表達(dá)量13周顯著高于8周,TβRⅠmRNA的表達(dá)量8周顯著高于13周。大鼠CCl4性肝纖維化8周、13周 ,護肝片組肝組織 TGF-β1及 TβRⅠmRNA的表達(dá)量均顯著低于模型組,但仍顯著高于正常組。
表4 Liver-Aid tablets對CCl4所致纖維化大鼠肝組織 TGF-β1 mRNA、TβRⅠmRNA表達(dá)量的影響Table 4 Effect of Liver-Aid tablets on mRNA expression of TGF-β1 and TβR Ⅰin carbon tetrachloride-induced hepatofibrotic rats
表5 造模8、13周正常組、模型組、Liver-Aid tablets組各數(shù)據(jù)間的相關(guān)系數(shù)Table 5 The correlation coefficient of data of normal group,model group,Liver-Aid tablets group between to each other during 8 and 13 weeks
5.相關(guān)分析
表5顯示,大鼠CCl4性肝纖維化8周,正常組、模型組及護肝片組大鼠肝組織的α-SMA陽性細(xì)胞數(shù)、NF-κB p65 蛋白、TGF-β1及 TβR ⅠmRNA 表達(dá)量相互間均呈顯著正相關(guān)。大鼠CCl4性肝纖維化13周,除α-SMA陽性細(xì)胞數(shù)與 TβRⅠmRNA表達(dá)量之間不相關(guān)之外,其余各數(shù)據(jù)之間均呈顯著正相關(guān)。
中藥護肝片(黑龍江葵花藥業(yè)股份有限公司)是糖衣片,由柴胡、茵陳、板藍(lán)根、五味子、豬膽粉、綠豆組成,有抗肝纖維化作用。本模型采用12.5%CCl4致大鼠肝纖維化的一般病理學(xué)改變結(jié)果顯示,造模8、13周,模型組肝組織正常肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞消失,匯管區(qū)和中央靜脈區(qū)膠原纖維增生,分割肝小葉形成大方形及小方形假小葉,模型組的肝損傷及其纖維化分級均顯著高于正常組,表明CCl4致大鼠肝纖維化造模成功。8、13周模型組肝損傷的病理組織學(xué)變化及纖維化分級間無明顯差異,但13周較8周有發(fā)展加重趨勢,這與8周肝纖維化已經(jīng)形成,而晚期(13周)肝纖維化可能處于相對穩(wěn)定狀態(tài)、膠原的合成與降解達(dá)到新的平衡有關(guān)。護肝片組的肝損傷及其纖維化分級均輕于模型組,進一步證實護肝片對大鼠CCl4慢性肝損傷及其纖維化形成有抑制作用[2]。
肝纖維化是肝臟對各種損傷的修復(fù)反應(yīng),在肝臟炎癥損傷過程申,HSC活化發(fā)生表型轉(zhuǎn)變而具有肌成纖維細(xì)胞(MFB)的特性,使 ECM-膠原蛋白合成增加,細(xì)胞收縮性增強,在肝纖維化的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用,HSC活化是肝纖維化形成過程的中心環(huán)節(jié)[8],α-SMA是其活化的標(biāo)志[9]。本實驗用12.5%CCl4致大鼠慢性肝損傷,α-SMA染色結(jié)果顯示,造模8、13周,模型組肝組織活化的 HSC(即α-SMA陽性細(xì)胞)數(shù)量均較正常組顯著增多,這與文獻報道一致。證實在肝纖維化過程中活化的 HSC數(shù)量增多,即 HSC被活化并大量增殖。在大鼠CCl4性肝纖維化8、13周時,模型組有明顯的肝纖維化形成,表明HSC的活化、增殖與ECM的沉積的現(xiàn)象是一致的,兩者關(guān)系密切。本次實驗中,出現(xiàn)13周模型組活化的HSC數(shù)量較8周顯著減少這一有趣的現(xiàn)象,對這一現(xiàn)象的解釋目前尚無文獻報道,我們推測可能是由于晚期肝纖維化已處于相對穩(wěn)定狀態(tài),膠原的合成與降解處新的平衡所致,有待于進一步研究。大鼠CCl4性肝纖維化8周,活化的HSC數(shù)量與NF-κB p65 蛋白、TGF-β1及 TβR ⅠmRNA 的表達(dá)均呈顯著正相關(guān);13周活化的 HSC數(shù)量也與NF-κB p65蛋白、TGF-β1mRNA的表達(dá)呈顯著正相關(guān);8、13周,護肝片組肝組織活化的 HSC數(shù)量均較模型組顯著減少,提示:①肝纖維化時 HSC的活化、增殖與 NF-κB p65 蛋白、TGF-β1及 TβR ⅠmRNA 的表達(dá)有關(guān);②護肝片的抗肝纖維化作用機制之一可能是抑制纖維化肝組織HSC的活化與增殖。
目前共克隆得到5種 TGF-β異構(gòu)體,命名為TGF-β1-5,在哺乳動物僅有 TGF-β1-3[10]。在肝臟TGF-β1是各種 TGF-β異構(gòu)體中最主要的存在形式,TGF-β1含量較 TGF-β2、TGF-β3高約 10 倍 ,TGF-β1是強有力的致纖維化的細(xì)胞因子,在肝纖維化時表達(dá)明顯增多,促進 HSC增殖活化,合成大量 ECM,在纖維化進程中起重要作用[5]。TGF-β1是肝纖維化主要的始動因子之一,研究證實肝纖維化時其表達(dá)增加[11]。TGF-β產(chǎn)生時均以非活性狀態(tài)存在,與相應(yīng)受體無結(jié)合活性。肝受損時,肝內(nèi)的炎癥細(xì)胞、HSC、KC等自分泌或旁分泌非活性 TGF-β1,非活性 TGF-β1被炎癥環(huán)境中的各種酶和細(xì)胞因子激活,刺激上述細(xì)胞進一步產(chǎn)生 TGF-β1,形成逐級放大效應(yīng) ,導(dǎo)致 TGF-β1大量生成和激活。活性 TGF-β1通過與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合而發(fā)揮作用,參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。TGF-β以自分泌和旁分泌方式參與 HSC的活化[5,12],促進 HSC合成各種膠原成分以及組織金屬蛋白抑制劑(TIM Ps),同時能夠抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(NMPs)的合成,引起ECM積聚而導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生[13]。研究表明護肝片抑制纖維化大鼠肝組織 TGF-β1及 TβRⅠ的蛋白的表達(dá)[2],試驗結(jié)果顯示,在CCl4性大鼠肝纖維化中晚期,肝組織中 TGF-β1及 TβRⅠ的mRNA的表達(dá)均呈明顯一致性增多,表明在肝纖維化過程中,TGF-β1及 TβRⅠ表達(dá)增加是由于其轉(zhuǎn)錄水平增加所致,且 TGF-β1與 TβRⅠ在肝纖維化過程中有協(xié)同作用,在中晚期肝纖維化中起重要作用;模型組肝組織,TGF-β1mRNA的表達(dá)量13周顯著高于8周,TβRⅠmRNA的表達(dá)量8周顯著高于13周,護肝片在mRNA水平上抑制中晚期纖維化肝組織 TGF-β1及 TβRⅠ的表達(dá),提示在肝纖維化不同時期,上述靶點的反應(yīng)性有所差異,可能受到多種因素的影響,其機制有待進一步研究;抑制TGF-β1及 TβRⅠmRNA的表達(dá)是護肝片抗肝纖維化的作用靶點之一。
TGF-β1的合成受核轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,目前發(fā)現(xiàn)的核轉(zhuǎn)錄因子主要有NF-κB、AP-1等。NF-κB在哺乳動物中最多見的是由p65和p50組成的異源二聚體。細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時,NF-κB位于細(xì)胞質(zhì),其p65亞基與抑制蛋白(Inhibitory kappa B,IκB)單體結(jié)合,覆蓋p50的核定位信號,使NF-κB與IκB以三聚體失活狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)機體受到外界因素刺激時,IκB發(fā)生磷酸化,并從NF-κB二聚體上解離,暴露p50的核定位信號,NF-κB得以激活并移位進入細(xì)胞核促進靶基因轉(zhuǎn)錄。TGF-β1活化因子組織轉(zhuǎn)谷氨酰酶(t TG)基因的啟動子中含有NF-κB的結(jié)合位點,因而 NF-κB能促進 TGF-β1表達(dá)。本試驗結(jié)果顯示,與正常組相比,8、13周模型組大鼠肝臟組織NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯增強,而且8、13周NF-κB p65蛋白與 TGF-β1及 TβR ⅠmRNA 表達(dá)呈顯著正相關(guān),提示 NF-κB參與肝纖維化反應(yīng),促進肝纖維化形成;肝纖維化過程中,NF-κB可能在介導(dǎo)TGF-β1的活化或產(chǎn)生中發(fā)揮一定的作用[14],NF-κB也可能還進一步在介導(dǎo) TβRⅠ的活化或產(chǎn)生中發(fā)揮一定的作用,有待進一步探討。本實驗結(jié)果還顯示,大鼠CCl4性肝纖維化8、13周,NF-κB p65蛋白的表達(dá)與活化的 HSC數(shù)量呈正相關(guān),提示 NF-κB參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展,其機制之一是 NF-κB參與HSC的活化與增殖。大鼠 CCl4性肝纖維化8、13周,護肝片組肝組織NF-κBp65蛋白表達(dá)均較模型組顯著減少,提示:①NF-κB可能是護肝片抗肝纖維化作用靶點之一;②護肝片可能通過抑制纖維化肝組織NF-κB的表達(dá)從而影響 TGF-β1和 TβRⅠ的表達(dá);③護肝片可能通過抑制纖維化肝組織NF-κB的表達(dá),進而導(dǎo)致纖維化肝組織活化的 HSC數(shù)量減少。
組織芯片(tissue chip)又稱組織微陣列(tissue microarray),是將幾十個甚至幾百個組織按預(yù)先設(shè)計的要求在某一載體上排列成矩陣的微縮組織切片。它具有平行、高通量對組織進行分析研究,節(jié)約組織原材料和檢測試劑,并因?qū)嶒灄l件一致,從而減少實驗誤差[15]。本研究制作了低密度肝組織芯片,直徑1mm的組織芯片包涵了3-5個肝小葉范圍,能充分展現(xiàn)肝纖維化的病理形態(tài)學(xué)改變。在組織芯片上做了 HE染色、網(wǎng)狀纖維染色、V G膠原纖維染色、免疫組化和原位雜交,既節(jié)約試劑成本、減輕實驗強度,又減少了實驗誤差,提高了不同組織之間染色結(jié)果的可比性。制作組織芯片過程中用定位器進行定位,使所取得的組織片具有代表性,收到較好效果,為中藥抗肝纖維化的研究提供了新的思路。
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圖 版 說 明
圖1 8wk正常組肝組織的NF-κB p65蛋白表達(dá)?!?00
圖2 8wk模型組肝組織的NF-κB p65蛋白表達(dá)?!?00
圖3 8wk護肝片組肝組織的NF-κB p65蛋白表達(dá)?!?00
圖4 13wk正常組肝組織的NF-κB p65蛋白表達(dá)?!?00
圖5 13wk模型組肝組織的NF-κB p65蛋白表達(dá)?!?00
圖6 13wk護肝片組肝組織的NF-κB p65蛋白表達(dá)?!?00
圖7 8wk正常組肝組織的 TGF-β1mRNA表達(dá)。×400
圖8 8wk模型組肝組織的 TGF-β1mRNA表達(dá)。×400
圖9 8wk護肝片組肝組織的 TGF-β1mRNA表達(dá)。×400
圖10 13wk正常組肝組織的 TGF-β1mRNA表達(dá)?!?00
圖11 13wk模型組肝組織的 TGF-β1mRNA表達(dá)?!?00
圖12 13wk護肝片組肝組織的 TGF-β1mRNA表達(dá)?!?00
圖13 8wk正常組肝組織的 TβRⅠmRNA表達(dá)?!?00
圖14 8wk模型組肝組織的 TβRⅠmRNA表達(dá)?!?00
圖15 8wk護肝片組肝組織的 TβRⅠmRNA表達(dá)?!?00
圖16 13wk正常組肝組織的 TβRⅠmRNA表達(dá)。×400
圖17 13wk模型組肝組織的 TβRⅠmRNA表達(dá)。×400
圖18 13wk護肝片組肝組織的 TβRⅠmRNA表達(dá)?!?00
EXPLANATIONOF FIGURES
Fig.1 NF-κB p65 protein expression ofhepatic tissue in the normal group during 8 weeks.Immunohistochemiscal staining×400
Fig.2 NF-κB p65 protein expression ofhepatic tissue in the model group during 8 weeks.Immunohistochemiscal staining×400
Fig.3 NF-κB p65 protein expression ofhepatic tissue in the liver-aid tablets(921mg kg d-)administration group during 8 weeks.Immunohistochemiscal staining×400
Fig.4 NF-κB p65 protein expression ofhepatic tissue in the normal group during 13 weeks.Immunohistochemiscal staining×400
Fig.5 NF-κB p65 protein expression ofhepatic tissue in the model group during 13 weeks.Immunohistochemiscal staining×400
Fig.6 NF-κB p65 protein expression ofhepatic tissue in the liver-aid tablets(921mg kg d-)administration group during 13 weeks.Immunohistochemiscal staining ×400
Fig.7 TGF-β1mRNA expression of hepatic tissue in the normal group during 8 weeks.Hybridization in situ staining×400
Fig.8 TGF-β1mRNA expression of hepatic tissue in the model group during 8 weeks.Hybridization in situ staining×400
Fig.9 TGF-β1mRNA expression of hepatic tissue in the liver-aid tablets(921mg kg d-)administration group during 8 weeks.Hybridization in situ staining×400
Fig.1 0 TGF-β1mRNA expression of hepatic tissue in the normal group during 13 weeks.Hybridization in situ staining×400
Fig.1 1 TGF-β1mRNA expression of hepatic tissue in the model group during 13 weeks.Hybridization in situ staining×400
Fig.1 2 TGF-β1mRNA expression of hepatic tissue in the liver-aid tablets(921mg kg d-)administration group during 13 weeks.Hybridization in situ staining×400
Fig.1 3 TβRⅠmRNA expression of hepatic tissue in the normal group during 8 weeks.Hybridization in situ staining×400
Fig.1 4 TβR ⅠmRNA expression of hepatic tissue in the model group during 8 weeks.Hybridization in situ staining×400
Fig.1 5 TβRⅠmRNA expression of hepatic tissue in the liver-aid tablets(921mg kg d-)administration group during 8 weeks.Hybridization in situ staining×400
Fig.1 6 TβRⅠmRNA expression of hepatic tissue in the normal group during 13 weeks. Hybridization in situ staining×400
Fig.1 7 TβR Ⅰ mRNA expression of hepatic tissue in the model group during 13 weeks.Hybridization in situ staining×400
Fig.1 8 TβRⅠmRNA expression of hepatic tissue in the liveraid tablets(921mg kg d-)administration group during 13 weeks.Hybridization in situ staining×400
Altered protein expression of NF-κBand mRNA expression of TGF-β1 and its type Ⅰreceptor and HSCs of hepatic tissue in the middleand late stage of rat hepatic fibrosisand the effect of liver-aid tabletson them
Wu Yichun*,Wu Qiang*1,Yang Yan1,Yang Feng1,Chen Minzhu1
(Dapartment of Pathology Anhui Medical College,Hef ei,Anhui,230601;1Department of Pathology Anhui Medical University,Hef ei,Anhui 230032,China)
Objective To study the effect of Liver-aid tablets on the activation and proliferation of hepatic stellate cells(HSCs)and protein expression of Nf kappaB(NF-κB)and mRNA expression of transforming growth factor beta-1(TGF-β1)and its type Ⅰreceptor(TβR Ⅰ)in the middle and late stage of rat hepatic fibrosis.Methods SD rats were divided into 3 group s:normal control,model control and group of Liver-aid tablets.CCl4(12.5%,4ml·kg-1)was injected subcutaneously in model rats twice a week for 8 and 13 weeks.The drug(921mg·kg-1in the group of Liver-aid tablets,but 0.5%CMC-Na in control groups)was given intragastrically once a day for 8 and 13 weeks.The rats were killed at the end of 8th and 13th week respectively,the left liver tissue was then used to make tissue microarrays(TMA)..IHC S-P method was used to detect the protein expression ofα-smooth muscle actin(α-SMA)and NF-κB p65,while the mRNA expression of TGF-β1and TRβ Ⅰwas detected by ISH.α-SMA positive cells were counted in three random 250μm ×250μm areas under light microscop(×200).The expression of NF-κB protein,TGF-β1and TβRⅠmRNA were quantified by MetaMorp h imaging analysis system.Results 1.Afeter 8 and 13 weeks,the degreesof liver injury and fibrosis grades in the model group were higher than those in the normal group(P<0.01),which was ameliorated remarkably by Liver-aid tablets.2.The number of activated HSCs in fibrotic model liver tissue was more than that in the normal group after 8 and 13 weeks(P<0.01).The protein expression of NF-κB,and the mRNA expression of TGF-β1and TβR Ⅰin the model group were stronger than those in the normal group after 8 and 13 weeks(P<0.01).3.Liver-aid tablets inhibited not only the activation and proliferation of HSCs,but also the protein expression of NF-κB and mRNA expression of TGF-β1and TβR Ⅰof fibrotic liver tissue after 8 and 13 weeks(P<0.01).Conclusion Liver-aid tablets have anti-fibrosis effects on CCl4-induced rat liver fibrosis,which might be performed through the pathway of inhibiting the activation and proliferation of HSCs,the protein expression of NF-κB,and the mRNA expression of TGF-β1and TβR Ⅰ.
Hepatic fibrosis; Liver-aid tablets; HSC; NF-κB; TGF-β1; TGF-βR Ⅰ;Immunohistochemistry; In situ hybridization; Tissue microarrays
R322.47 R285.5
A
10.3870/zgzzhx.2011.03.003
2010-12-14
2011-04-01
安徽省自然科學(xué)研究基金(99044126);安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點項目(2006KJ092A)
吳義春,男(1973年),漢族,副教授。
*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)
中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志2011年3期