郭艷麗 郭 煒 鄺 鋼 楊植彬 曹延萍 董稚明

食管鱗狀細胞癌中DICKKOPF-3基因的甲基化狀態(tài)及表達

郭艷麗 郭 煒 鄺 鋼 楊植彬 曹延萍1董稚明＊

(河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院河北省腫瘤研究所病理研究室;1河北省中醫(yī)院病理科石家莊050011)

目的 檢測食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell cancer,ESCC)中 Wnt通路拮抗基因DICKKOPF-3(DKK3)的甲基化狀態(tài),探討其與 ESCC發(fā)生的關(guān)系。方法 應用甲基化特異性PCR(methylation specific PCR,MSP)及RTPCR的方法檢測78例ESCC及相應癌旁非腫瘤組織中DKK3基因的甲基化狀態(tài)及mRNA表達情況,應用免疫組化的方法檢測通路中心因子β-catenin蛋白及下游靶基因cyclinD1的表達,并分析其與食管癌發(fā)生的關(guān)系。結(jié)果 在 ESCC組織中,DKK3基因的甲基化頻率為37.2%(29/78),明顯高于癌旁非腫瘤組織(χ2=35.622,P=0.000);癌組織中該基因的甲基化率與腫瘤患者臨床分期相關(guān)(χ2=4.705,P=0.030),而與組織學分級無關(guān);食管癌中DKK3基因 mRNA的陽性表達率為65.4%(51/78),明顯低于癌旁非腫瘤組織(χ2=13.298,P=0.000)。在發(fā)生甲基化的食管癌組織中該基因的mRNA表達缺失及β-catenin蛋白的異質(zhì)表達率均明顯高于未發(fā)生甲基化的癌組織,且差異有統(tǒng)計學意義(χ2mRNA=29.141,P=0.000;χβ2-catenin=6.245,P=0.012)。食管癌中cyclinD1的表達明顯高于癌旁組織,且癌組織中該蛋白的表達與DKK3基因的甲基化狀態(tài)相關(guān)(χ2=4.921,P=0.027)。結(jié)論 ESCC組織中DKK3基因高甲基化導致的轉(zhuǎn)錄沉默可能與食管癌的發(fā)生有關(guān),并可能通過活化Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導通路促進下游靶基因cyclinD1的過表達發(fā)揮作用。

ESCC; 甲基化; DICKKOPF-3基因; Wnt; 細胞周期

Wnt/β-catenin信號傳導通路是調(diào)控細胞生長、發(fā)育和分化的關(guān)鍵途徑,研究發(fā)現(xiàn)該通路的異常激活與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[1]。DKK3屬Dickkopf s家族成員之一,是Wnt信號途徑的拮抗因子,通過與其相應的受體結(jié)合來調(diào)控細胞內(nèi)的信號傳導[2]。研究發(fā)現(xiàn),在多種腫瘤中均存在該基因表達的異常,但機制仍未完全闡明。本研究通過對中國食管癌高發(fā)區(qū)78例食管鱗狀細胞癌患者的癌及癌旁非腫瘤組織中DKK3基因甲基化狀態(tài)及mRNA表達的檢測,分析其與通路相關(guān)因子β-catenin蛋白及下游靶基因cyclinD1的關(guān)系,探討其對食管鱗癌發(fā)生可能的作用,以期為食管癌發(fā)病的分子機制提供重要的參考指標。

材料和方法

1.主要試劑 蛋白酶 K(Merck公司);氫醌(Sigma公司);亞硫酸氫鈉(Sigma公司);Wizard DNA純化試劑盒(Promega公司);Trizol(Invitrogen,USA),引物(北京賽百勝公司合成)。即用型免疫組織化學SP試劑盒(SP-9000,中衫金橋),鼠抗人單克隆抗體β-catenin(CA T-5H10,Zymed Labortories,1:100稀釋),CyclinD1(SP4,Santa cruz,1:100稀釋)

2.研究對象和標本來源 研究對象選擇河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院胸外科及河北省磁縣腫瘤醫(yī)院2004-2006年收治的食管癌患者78例,并確定患者均來自河北省太行山區(qū)的食管癌高發(fā)區(qū),其中男性57例,女性 21例,年齡范圍 26-78歲,平均年齡57.9歲。全部患者術(shù)前均未經(jīng)化療和放療。每例患者均取癌組織原發(fā)灶及距癌組織2-5cm處的癌旁組織,手術(shù)切除標本一部分-80℃低溫冰箱保存提取DNA及 RNA,另一部分標本進行石蠟包埋,常規(guī) HE染色,證實癌旁均為非腫瘤組織,并確定標本的組織學類型均為食管鱗狀細胞癌?；颊叩呐R床分期及組織學分級情況見表1。本研究經(jīng)所有患者知情同意。

3.方法

3.1 甲基化特異性 PCR(methylation-specific PCR,MSP)法 采用酚/氯仿抽提法,提取組織DNA,并用分光光度計測定 260nm與280nm處光密度比值,以此判定DNA純度和含量。取適量DNA標本用亞硫酸氫鹽處理,處理后的標本按Wizard DNA純化試劑盒說明進行純化,再進行PCR。同一樣品DNA在亞硫酸氫鹽修飾前與修飾后均用甲基化特異性引物和非甲基化特異引物擴增,如修飾前無任何目的條帶擴增而修飾后有目的條帶擴增,則亞硫酸氫鹽修飾完全。經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后,DNA中的C轉(zhuǎn)變?yōu)閁,而基因的Cp G島發(fā)生甲基化后,則不能發(fā)生這種改變,根據(jù)此原理設計相應的引物,檢測該基因是否發(fā)生甲基化。甲基化 引 物 為 5′-GGGGCGGGCGGCGGGGC-3′(上游),5′-ACA TCTCCGCTCTACGCCCG-3′(下游);非甲 基 化 引 物 為 5′-TTA GGGGTGGGTGGTGGGGT-3′(上 游),5′-CTACA TCTCCACTCTACACCCA-3′(下游),產(chǎn)物大小分別為120和126bp;PCR反應條件為95°C預變性10 min后,94°C變性45 s,58°(甲基化)或 56°(非甲基化)退火 50 s,72°C延伸45 s,40個循環(huán)后,72°C繼續(xù)延伸10 min。用經(jīng)甲基化酶(Sss I)處理以后的基因組DNA作為甲基化的陽性對照,用無消化系統(tǒng)腫瘤及其它系統(tǒng)腫瘤的正常人外周血DNA作為非甲基化的陽性對照,陰性對照則用滅菌雙蒸水取代DNA模板進行PCR。另隨機選取10%標本進行重復實驗以驗證結(jié)果的可靠性。

3.2 RT-PCR檢測 按 Trizol試劑說明書提取組織總 RNA,并參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Reverse Transcription System A 3500,Promega公司)說明將 RNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。mRNA合成引物為5′-ACA GCCACA GCCTGGTGTA-3′ ( 上 游 ),5′-CCTCCA TGAA GCTGCCAAC-3′(下游),產(chǎn)物為120bp;GAPDH 引 物 為 5′-GGGAAACTGTGGCGTGA T-3′ ( 上 游 ),5′- GTGGTCGTTGA TTTCAA T-3′(下游),產(chǎn)物為 342bp;反應條件為:95℃預變性3min后,94℃變性45s,退火45s,72℃延伸 45s,共 30個循環(huán),最后 72℃繼續(xù)延伸5min。PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳,GAPDH作為內(nèi)參照。

3.3 免疫組化檢測β-catenin及cyclinD1的表達 應用常規(guī)SP法。石蠟切片常規(guī)脫蠟,梯度酒精水化。3%甲醇過氧化氫封閉后用p H8.5的EDTA高壓修復3 min,羊血清封閉,再依次加入一抗、二抗和三抗,DAB顯色,蘇木精復染。以PBS代替一抗做空白對照。

4.統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS軟件包(11.5版)進行。各組間的差異用χ2檢驗及連續(xù)性校正進行分析,雙側(cè)檢驗。P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.食管鱗狀細胞癌組織中DKK3基因甲基化狀態(tài)分析

78例食管鱗癌及相應癌旁組織均成功進行了MSP檢測。擴增后,若甲基化引物擴增出了特異性條帶,而非甲基化引物未擴增出條帶,則為完全甲基化(圖2,case2:T);若甲基化引物和非甲基化引物均擴增出了條帶,則為不完全甲基化(圖2,case3:T);若只有非甲基化引物擴增出了條帶,則為非甲基化(圖2,case1:T,N;case2:N;case1:N)。將不完全甲基化計入甲基化進行統(tǒng)計,則食管癌組織中DKK3基因的甲基化率為37.2%(29/78),而相應癌旁非腫瘤組織中未檢測到該基因的甲基化條帶,癌組織中DKK3基因的甲基化頻率明顯高于癌旁非腫瘤組織(χ2=35.622,P=0.000)。DKK3基因的甲基化頻率在Ⅲ、Ⅳ期腫瘤患者中明顯高于Ⅰ、Ⅱ期腫瘤患者,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);而該基因的甲基化頻率與組織學分級無關(guān)(表1)。

表1 食管鱗癌中DKK3基因甲基化狀態(tài)分析Table 1 Analyses of DKK3 gene methylation status in ESCC

2.食管鱗癌DKK3基因mRNA表達情況及其與基因甲基化的關(guān)系

食管鱗癌中DKK3基因的mRNA表達陽性率為65.4%(51/78),而癌旁非腫瘤組織中其陽性率為89.7%(70/78),明顯高于腫瘤組織 (χ2=13.298,P=0.000);由圖3可見,在列舉的3例食管癌標本中(T),該基因的mRNA均呈缺失表達,在相應的癌旁非腫瘤組織中(N),該基因呈陽性表達。在高甲基化組的食管癌組織中該基因mRNA表達缺失率(21/29,72.4%)明顯高于未發(fā)生甲基化的癌組織(6/49,12.2%;P<0.01,表2),該基因家族啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)和其在mRNA水平上的表達缺失有明顯的相關(guān)性。

表2 食管鱗癌中高甲基化組與未發(fā)生甲基化組中DKK3基因mRNA表達分析Table 2 DKK3 genemRNA expression between hypermethylation and unmethylation group s in ESCC

3.食管鱗癌中DKK3基因甲基化狀態(tài)與βcatenin蛋白及CyclinD1表達的相關(guān)性分析

將β-catenin的胞質(zhì)/胞核的異常積聚(胞質(zhì)和/或胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒)定義為異質(zhì)表達,將胞膜著色或無著色定義為陰性表達;將CyclinD1的胞核表達定義為陽性表達(圖1)。食管癌組織中β-catenin蛋白的異質(zhì)表達率為69.2%(54/78),而相應癌旁非腫瘤組織中其異質(zhì)表達率僅為12.8%(10/78),差異有統(tǒng)計學意義(χ2=51.293,P=0.000);食管癌中CyclinD1的陽性表達率為75.6%(59/78),明顯高于癌旁非腫瘤組織(29/78,37.2%;χ2=23.463,P=0.000)。在發(fā)生甲基化的29例食管癌組織中,同時存在β-catenin異質(zhì)表達的有25例,異質(zhì)表達率為86.2%,明顯高于未發(fā)生甲基化的癌組織(29/49,P<0.05,表 3,圖 1);而 CyclinD1 在發(fā)生甲基化組的食管癌組織中的異質(zhì)表達率為89.6%,明顯高于未發(fā)生甲基化的癌組織(33/49,67.3%,P<0.05,表 3,圖 1)。β-catenin 蛋白的異質(zhì)表達及CyclinD1的高表達與DKK3基因的甲基化狀態(tài)有明顯的相關(guān)性。

表3 食管鱗癌中高甲基化組與未發(fā)生甲基化組中β-catenin蛋白及CyclinD1表達情況分析Table 3 Theectopic expression ofβ-catenin protein and positive-expression of CyclinD1 between hypermethylation and unmethylation groups in ESCC

討 論

DKK3基因是Dickkopf家族成員,位于染色體11P15.1上,長47100bp,分子量約38.3kDa[3]。其作為腫瘤候選抑癌基因,是經(jīng)典Wnt信號傳導通路的拮抗因子,可通過與Wnt受體復合體競爭性結(jié)合來選擇性的抑制通路的活化,而拮抗基因的沉默會使其失去對通路的抑制作用,使信號向下傳導,促進下游靶基因過度表達。研究發(fā)現(xiàn),在多種腫瘤中均存在DKK3表達的缺失,但引起表達下調(diào)的機制仍未完全闡明。研究表明,DKK3基因啟動子區(qū)富含5’端Cp G島[4],而啟動子區(qū)Cp G島的高甲基化是引起抑癌基因表達下調(diào)的重要機制之一[5]。此次實驗在對食管癌及癌旁組織中的MSP檢測中發(fā)現(xiàn),癌組織中該基因頻繁發(fā)生甲基化,明顯高于癌旁非腫瘤組織,提示該拮抗基因的高甲基化可能與食管鱗癌的發(fā)生有關(guān)。此外發(fā)現(xiàn),DKK3基因的高甲基化與其mRNA表達的缺失有明顯的相關(guān)性,提示啟動子區(qū)甲基化引起的表觀遺傳學沉默可能是食管鱗癌中該基因表達沉默的一個重要機制。同時,研究發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)腫瘤組織樣本中該基因的甲基化現(xiàn)象占有主導地位,具有特異性,但仍有部分癌旁非腫瘤組織中出現(xiàn)了該基因的甲基化現(xiàn)象,但均表現(xiàn)為不完全甲基化。究其原因,一是可能由于癌旁組織中混有微量的光學顯微鏡下難以觀察到的腫瘤組織,或是由于這種檢測出甲基化的癌旁組織具有癌變潛能,Klump B等在對Barrett’s食管的研究中發(fā)現(xiàn),在正常組織中檢測到P16基因高甲基化的患者隨后出現(xiàn)了惡性轉(zhuǎn)化[6]。因此,這種腫瘤相關(guān)基因的表觀遺傳學失活可能是腫瘤發(fā)生的早期事件。同時,研究發(fā)現(xiàn),DKK3基因的高甲基化現(xiàn)象與腫瘤的臨床分期相關(guān),而與病理分級無關(guān),這與 Urakami和Yu等[2,7]在對膀胱腫瘤和胃癌的研究相似,提示DKK3基因的高甲基化對食管鱗癌的不良預后有一定的指導意義。

β-catenin是Wnt信號傳導通路的中心因子,胞漿內(nèi)β-catenin的積聚是通路激活以及靶基因過表達的關(guān)鍵性的一步。當該通路處于正常傳導狀態(tài)時,細胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin可通過由 Axin、APC、GSK-3β形成的降解復合體磷酸化而降解,使胞漿內(nèi)β-catenin含量保持在較低水平;但當通路激活時,Wnt蛋白與受體結(jié)合以某種方式使降解復合物中GSK3β失活,從而抑制了β-catenin的降解,導致其在胞質(zhì)內(nèi)穩(wěn)定的累積。這種累積打破了細胞內(nèi)原有的β-catenin出入核平衡,使β-catenin易位于細胞核,與L EF1/TCF轉(zhuǎn)錄復合體結(jié)合,調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[1]。Lee等[8]在對宮頸癌的研究中發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)內(nèi)β-catenin的表達水平明顯下降,DKK3基因可作為β-catenin的一個負性調(diào)節(jié)因子,并有利于通路的激活。而Sato等[4]在對前列腺癌的細胞株的研究指出,該基因?qū)Ζ?catenin的異質(zhì)表達及通路的異常激活無明顯影響。此次實驗也觀察了DKK3基因甲基化狀態(tài)與β-catenin蛋白異質(zhì)表達的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)食管癌組織中β-catenin蛋白的異質(zhì)表達明顯高于癌旁組織,提示該通路在食管癌中可能處于激活狀態(tài);同時在該基因發(fā)生甲基化的食管癌組織中βcatenin的異質(zhì)表達率明顯高于未發(fā)生甲基化的癌組織,提示該基因的高甲基化與β-catenin蛋白異質(zhì)表達有關(guān),并可能通過Wnt/β-catenin信號傳導通路的活化參與食管癌的發(fā)生。研究結(jié)果有所差異,一是可能由于腫瘤類型不同,或是可能由于體內(nèi)與體外研究的微環(huán)境不同造成的。CyclinD1在最近的研究中已經(jīng)確定是Wnt信號通路的下游靶基因。此次研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)生DKK3基因甲基化組中 CyclinD1的陽性表達率明顯高于未發(fā)生甲基化的癌組織。提示DKK3基因的高甲基化可引起CyclinD1的過表達,通過對細胞周期的影響參與了食管癌的發(fā)生發(fā)展。

本研究結(jié)果揭示在食管鱗狀細胞癌中DKK3基因呈高甲基化狀態(tài),并有可能通過Wnt/β-catenin信號傳導通路的激活引起下游靶基因CyclinD1的過表達,而參與了食管癌的發(fā)生。

[1]Nelson WJ,Nusse R.Convergence of Wnt,beta-catenin,and cadherin pathways.Science,2004,303(5663):1483-1487

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圖 版 說 明

圖1 發(fā)生甲基化及未發(fā)生甲基化的食管癌組織中β-catenin及CyclinD1的表達情況。A:高甲基化的食管癌組織中β-catenin的異質(zhì)表達;B:未發(fā)生甲基化的食管癌組織中β-catenin的正常表達;C:高甲基化的食管癌組織中CyclinD1的陽性表達;D:未發(fā)生甲基化的食管癌組織中CyclinD1的陰性表達;

圖2 DKK3基因甲基化狀況分析

圖3 DKK3基因mRNA表達情況

EXPLANATIONOF FIGURES

Fig.1 The expression ofβ-catenin and CyclinD1 between hypermethylation and unmethylation groups in ESCC(DAB×400)A:The abnormal expression ofβ-catenin in hypermethylation groups of ESCC;B:The normal expression ofβ-catenin in unmethylation groups of ESCC;C:The positive expression of CyclinD1 in hypermethylation groups of ESCC;;D:The negative expression of CyclinD1 in unmethylation groups of ESCC;

Fig.2 Methylation analysis of DKK3 gene MSP results of the DKK3 genes in 3 matched pairs(case1-case3)of tumor tissue(T)and non-concerous tissue(N).M:Methylated genes;U:Unmethylated genes.

Fig.3 The mRNA expression of DKK3 genes.RT-PCR results of the DKK3 gene in 3 matched pairs(case1-case3)of tumor tissues(T)and non-concerous tissues(N).GAPDH is shown as a control.Most of the DKK3 gene mRNA expression was lower in ESCC tissues than those in non-concerous tissues.

Hypermethylation of DICKKOPF-3 gene and aberrant expression of cyclin D1 in esophageal squamous cell cancer

Guo Yanli,Guo Wei,Kuang Gang,Yang Zhibin,Cao Yanping1,Dong Zhiming＊
(Pathology L aboratory of Hebei Cancer Institute,The f ourth Hospital of Hebei Medical University,1Department of Pathology,Hospital of Traditional Chinese Medicine,of Hebei Provience,Shijiazhuang 050011,China)

Objective To investigate the promoter methylation of the DICKKOPF-3(DKK3)gene in esophageal squamous cell cancer(ESCC).Methods MSP and RT-PCR were applied respectively to examine the Cp G methylation of the DKK3 promoter and its mRNA expression in 78 samples of ESCC and corresponding adjacent non-concerous tissues,and immunohistochemistry was used to determine the protein expression ofβ-catenin(the key factor of the Wnt signalling pathway)and cyclin D1(the target geneof this pathway).Results In the ESCC tissues,the f requency of DKK3 gene promoter methylation was 37.2%(29/78),significantly higher than that in adjacent tissues(χ2=35.622,P=0.000).The hypermethylation of DKK3 gene had correlation with clinical stage(χ2=4.705,P=0.030),but not with pathology classification(P>0.05).The positive rate of DKK3 gene mRNA expression was 65.4%(51/78)in ESCC tissues,lower than that in adjacent tissues(χ2=13.298,P=0.000).The loss of mRNA expression and the ectopic expression ofβ-catenin were significantly more f requent in tumor tissues than in adjacent non-cancerous tissues(χ2mRNA=29.141,P=0.000;χ2β-catenin=6.245,P=0.012).Cyclin D1 was significantly more f requent in tumor tissues than in adjacent non-cancerous tissues and correlated with DKK3 gene hypermethylation(χ2=4.921,P=0.027).Conclusion Methylation of the DKK3 promoter may be one of the mechanisms resulting in transcription silence,which may contribute to hyper-expression of cyclin D1 through aberrant canonical Wnt/-catenin signaling pathway.

ESCC; Methylation; DICKKOPF-3 gene; Wnt; Cyclin D1

R735.1

A

10.3870/zgzzhx.2011.03.005

2010-12-01

2010-12-14

河北省醫(yī)學科學研究重點課題計劃項目資助(20090466)

郭艷麗,女(1980年),碩士,主治醫(yī)師。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)