靳 君 陜聲國(guó)＊ 張端蓮

WWOX蛋白在皮膚血管瘤中的異常表達(dá)及意義

靳 君1陜聲國(guó)1＊張端蓮2

(1武漢大學(xué)人民醫(yī)院整形外科,湖北430060;2武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系,湖北430071

目的 應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)不同時(shí)期血管瘤組織中WWOX蛋白的表達(dá),探討其在血管瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制。方法 收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院病理科2005年9月-2009年12月皮膚毛細(xì)血管瘤存檔蠟塊50例,其中男性25例,女性25例。采用免疫組織化學(xué)S-P法檢測(cè)50例皮膚血管瘤增生期、退化期及正常皮膚組織WWOX蛋白的表達(dá)水平,采用 HPIAS-1000圖文報(bào)告管理系統(tǒng)對(duì)WWOX蛋白的表達(dá)進(jìn)行定量分析,并用SPSS11.5軟件對(duì)各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽(yáng)性顆粒的平均光密度、陽(yáng)性面積率做單因素方差分析和SNK(q)檢驗(yàn)。結(jié)果 在增生期血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中可見(jiàn)少量的棕黃色顆粒,WWOX蛋白弱表達(dá)。正常皮膚組及退化組血管內(nèi)皮細(xì)胞中可見(jiàn)密集分布的棕黃色顆粒,WWOX蛋白高表達(dá)。增生期組WWOX蛋白的表達(dá)明顯低于退化期組和正常皮膚組(P<0.05)。結(jié)論 WWOX蛋白在增生期血管瘤組織中表達(dá)減少或缺失,可能與血管瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。

血管瘤; 抑癌基因; WWOX蛋白

血管瘤是最常見(jiàn)的嬰幼兒良性腫瘤,其特點(diǎn)是通過(guò)未成熟的內(nèi)皮細(xì)胞彌散增殖而在出生后快速生長(zhǎng),之后自發(fā)消退。嬰幼兒血管瘤的生長(zhǎng)和消退與其它血管畸形有著很大的不同,血管畸形并不消退且可以發(fā)生在任何時(shí)期[1-2]。部分血管瘤可向周?chē)M織呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng),而且它的發(fā)病部位大多位于頭面部體表部位[3]。而目前的治療方法的成效很有限,一些治療方法的副作用也限制了其應(yīng)用。深入研究和了解血管瘤的發(fā)病機(jī)理將為治療血管瘤提供更好的治療手段。

WWOX(ww domain-containing oxidoreductase)基因是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的1個(gè)可能的腫瘤抑制基因,其表達(dá)缺失與乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。多項(xiàng)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)WWOX基因在實(shí)體瘤和細(xì)胞系中發(fā)生經(jīng)常性缺失。Bednarek等[3]用Northernblottnig和 RT-PCR的方法檢測(cè),乳腺癌細(xì)胞系中有不同水平的WWOX表達(dá),與細(xì)胞系的惡性程度呈負(fù)相關(guān),高侵襲性的細(xì)胞系如MDA-MB-231和MDA-MB-435中 WWOX低表達(dá)或基本檢測(cè)不到,而低侵襲性的細(xì)胞系如MCF7和T47D相對(duì)高表達(dá)。

本文通過(guò)應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法和圖像分析技術(shù)檢測(cè)血管瘤增生期、退化期以及正常皮膚組織中WWOX蛋白的表達(dá)水平,以探討其在血管瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制,為臨床上治療血管瘤提供更多參考和指導(dǎo)。

材料和方法

1材料

1.1 材料來(lái)源收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院病理科2005年9月-2009年12月皮膚毛細(xì)血管瘤存檔蠟塊50例,其中男性25例,女性25例。這些血管瘤所在的部位有頭皮、前額、眼瞼、耳背、頸部、背部、上臂、大腿、手和足的皮膚等。患者術(shù)前均未做任何輔助性治療。

1.2 材料分組 按Mulliken分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合PCNA的表達(dá)進(jìn)行分組:石蠟標(biāo)本中增生期血管瘤26例,退化期血管瘤24例。另取瘤組織周?chē)Ｆつw組織5例作對(duì)照。

1.3 主要試劑 鼠抗人WWOX單克隆抗體(購(gòu)于北京中杉生物技術(shù)有限公司);超敏即用型SP通用型免疫組織化學(xué)試劑盒(購(gòu)于福州邁新公司);DAB顯色試劑盒及多聚賴氨酸(購(gòu)于北京中杉生物技術(shù)有限公司)。

2方法

2.1 常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片及 HE染色

2.2 免疫組織化學(xué)SP法

具體步驟:(1)4μm組織切片常規(guī)脫蠟入水;(2)抗原修復(fù)(檸檬酸緩沖液微波抗原修復(fù)法);(3)滴加3%過(guò)氧化氫,37℃濕盒孵育10min以抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性;(4)正常羊血清37℃濕盒孵育10min以減少非特異性背景;(5)分別滴加一抗(WWOX;1:100);(6)滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物復(fù)合物37℃濕盒孵育;(7)滴加新鮮配置的DAB顯色液顯色;(8)蘇木素復(fù)染;(9)梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片并鏡檢;(10)用 PBS代替一抗作為陰性對(duì)照組,購(gòu)買(mǎi)的陽(yáng)性片作為WWOX蛋白的陽(yáng)性對(duì)照組。

3.免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷

(1)WWOX蛋白以胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)。陰性對(duì)照組除細(xì)胞核染成藍(lán)色外,應(yīng)無(wú)棕黃色反應(yīng)物。

(2)采用 HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告管理系統(tǒng)(同濟(jì)千屏影像公司)對(duì)WWOX蛋白的表達(dá)進(jìn)行定量分析,每張切片隨機(jī)選取5個(gè)完整而不重疊的高倍鏡視野(×400),測(cè)定每個(gè)視野下陽(yáng)性反應(yīng)的平均光密度、陽(yáng)性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積,計(jì)算陽(yáng)性面積率。以每例5個(gè)視野的平均光密度、陽(yáng)性面積率的平均值作為該例的測(cè)量值。(陽(yáng)性面積率=單位面積中陽(yáng)性反應(yīng)的總面積/單位面積中細(xì)胞的總面積×100%)

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用SPSS11.5軟件對(duì)各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽(yáng)性顆粒的平均光密度、陽(yáng)性面積率做單因素方差分析和SNK(q)檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。

結(jié) 果

1.HE染色正常皮膚真皮內(nèi)可見(jiàn)毛細(xì)血管管腔較小,由1-2個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞圍成,胞質(zhì)較少,內(nèi)皮細(xì)胞核扁平(圖1)。增生期血管瘤組織中可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞呈團(tuán)快狀或片狀,內(nèi)皮細(xì)胞核肥大而淡染(圖2)。退化期血管瘤組織中可見(jiàn)血管腔變大,內(nèi)皮細(xì)胞減少,內(nèi)皮細(xì)胞核扁平(圖3)。

2.WWOX蛋白的表達(dá)增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞核或胞質(zhì)內(nèi)有較少棕黃色顆粒,WWOX蛋白表達(dá)弱或無(wú)表達(dá)(圖4);退化期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有較多棕黃色顆粒,WWOX蛋白表達(dá)強(qiáng)(圖5);正常組織內(nèi)有較多棕黃色顆粒,WWOX蛋白表達(dá)強(qiáng)(圖6)。圖像分析結(jié)果見(jiàn)表。增生期組 WWOX蛋白的表達(dá)明顯低于退化期組和正常皮膚組織組(P<0.05),而后兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(表 1)

表1 血管瘤不同時(shí)期WWOX蛋白表達(dá)的平均光密度和陽(yáng)性面積率(ˉx±s)Table 1 the average optical density and the rate of WWOX positive area of in differ period of human dermal hemangiomas(ˉx ±s)

討 論

嬰幼兒血管瘤是最常見(jiàn)的幼兒良性腫瘤,以毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖為主要組織學(xué)特點(diǎn)。血管瘤在其生長(zhǎng)、大小、位置和深度上變化很大。多數(shù)損傷相對(duì)較小(平均大小為8.6cm2),在皮膚中零散隱藏分布,對(duì)人體的影響較小[4-5]。然而,約20%的患者是多重?fù)p傷,約10%的腫瘤快速生長(zhǎng)。在這些病例中,由于其大小和位置的不同,這些血管瘤對(duì)人體造成了威脅,有的甚至破壞了正常的組織或危及生命[6-9]。例如,口、鼻、眼部位的血管瘤可能會(huì)妨礙正常的進(jìn)食、呼吸或視力。

血管瘤約80%的損傷位于頭頸部。面部損傷趨向于在臉的獨(dú)立發(fā)育區(qū)域邊界或其附近發(fā)生[10]。最常發(fā)的部位是前頸部、前額和耳周區(qū)。粘膜占10%。40%的損傷伴有諸如潰瘍、出血、感染、疼痛、心力衰竭、氣管傷害或眼睛傷害[11],有些甚至危及生命。血管瘤自然病程包括增生期、退化期和退化完成期。一般認(rèn)為,血管瘤是血管生長(zhǎng)及修復(fù)的紊亂,其主要的特征是毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞增生[12]。這也與腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,即細(xì)胞增殖失控、分化障礙及凋亡受阻等相一致。

目前認(rèn)為腫瘤是一種基因性疾病,原癌基因激活、抑癌基因功能喪失以及一些修飾基因功能的改變導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。具體的說(shuō),腫瘤的發(fā)生與致癌因子誘導(dǎo)染色體的常見(jiàn)脆性位點(diǎn),引起相關(guān)抑癌基因的失活有著密切的關(guān)系?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)并鑒定出80多個(gè)常見(jiàn)脆性位點(diǎn),位于所有個(gè)體染色體的特殊部位。近年來(lái)研究已證實(shí)染色體脆性和DNA不穩(wěn)定性有著正相關(guān)性,一些常見(jiàn)脆性位點(diǎn)與多種腫瘤中DNA不穩(wěn)定的區(qū)域有著明確的聯(lián)系。

WWOX基因作為一個(gè)位于普通型脆性位點(diǎn)基因,它在射線、病毒、某些毒素的作用下均有可能發(fā)生基因片段的變異或者缺失,如果所變異或缺失的部分正好是能抑制細(xì)胞異常生長(zhǎng)的基因,那么這種變異和缺失可能抑制凋亡、促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。大量研究發(fā)現(xiàn),大部分腫瘤細(xì)胞中的 WWOX蛋白水平顯著低于正常細(xì)胞中的表達(dá)水平[13-16]。說(shuō)明腫瘤的各種致癌因素可能通過(guò)直接或間接途徑損害到WWOX基因所在的染色體脆性位的陽(yáng)性表達(dá)。

WWOX蛋白含有414個(gè)氨基酸,在它的氨基末端有兩個(gè)WW結(jié)構(gòu)域,WW功能域主要與蛋白之間相互作用有關(guān)[17],而蛋白之間的相互作用是機(jī)體抑癌基因通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制腫瘤生長(zhǎng)所必需。研究表明,多種腫瘤組織中的WWOX蛋白均存在弱表達(dá)或缺失(如乳腺癌,食管癌等),而 WWOX蛋白表達(dá)減少或缺失,則減少其與其他抑制腫瘤蛋白之間的相互作用,從而減少腫瘤細(xì)胞增生的抑制因素,可能直接導(dǎo)致腫瘤的增殖。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法對(duì)WWOX蛋白在50例人皮膚血管瘤組織中的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中WWOX蛋白的含量明顯低于退化期和正常組織 (P<0.05),WWOX蛋白表達(dá)在增生期血管瘤組織中表達(dá)減少或缺失,推測(cè)WWOX蛋白表達(dá)下調(diào)可能在血管瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用。

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圖 版 說(shuō) 明

圖1 增生期血管瘤 血管瘤組織中可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞呈團(tuán)快狀或片狀,內(nèi)皮細(xì)胞核肥大而淡染(→),HE×400

圖2 退化期血管瘤 內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量減少,血管腔增大,結(jié)締組織增多,內(nèi)皮細(xì)胞核扁平(→),HE×400

圖3 正常皮膚組織 毛細(xì)血管由1到2個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞圍成,內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)薄,僅含核的部分略厚,內(nèi)皮細(xì)胞核扁平(→),HE×200

圖4 增生期血管瘤WWOX蛋白的表達(dá) 增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞核或胞質(zhì)內(nèi)有較少棕黃色顆粒(→),WWOX蛋白表達(dá)弱或無(wú)表達(dá),S-P×400

圖5 退化期血管瘤WWOX蛋白的表達(dá) 退化期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有較多棕黃色顆粒,WWOX蛋白表達(dá)強(qiáng)(→),S-P×400

圖6 正常對(duì)照組WWOX蛋白的表達(dá) 正常皮膚組織內(nèi)有較多棕黃色顆粒,WWOX蛋白表達(dá)強(qiáng)(→),S-P×400

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Proliferating hemangioma.Endothelial cells proliferated in clustered form.Thenucleus of endothelial cells turned hypertrophic and were stained weakly(→).HE×400 in normal dermal tissue

Fig.2 Involuting hemangioma.The lumen of blood vessels enlarged.Connective tissues increased.The number of endothelial cells decreased,and the nucleus of endothelial cells turned thin and flat(→).HE ×400

Fig.3 normalskin Group.the cytoplasm of capillary endothelial cells was thin,only nucleus part was a little thicker,and nucleus was flat(→).HE ×400

Fig.4 WWOX expression in proliferating hemangioma.There were few brown particles incytoplasm the of proliferating endothelial cells, WWOX expressed weakly(→).S-P ×400

Fig.5 WWOX expression in involuting hemangioma.There were plenty of brown particles in cytoplasm the of involuting endothelial cells,WWOX expressed strongly(→).S-P ×400

Fig.6 WWOX expression in normalskin Group.There were plenty of brown particles in cytoplasm the of normal skin Grou endothelial cells,WWOX expressed strongly(→).S-P ×400

Abnor mal Expression and signif icance of WWOX protein in dermal hemangioma

Jin Jun1,Shan Shengguo1＊,Zhang Duanlian2
(1Department of Plastic Surgery,Renmin Hospital of Wuhan University,Hubei 430060;2Department of Anthropotomy and Histology and Embryology,School of Medicine,Wuhan University,Hubei 430071)

Objective Using the method of immuno-histochemical to detect the expression of WWOX protein in hemangioma tissue at different stages,then to study its mechanism of action in the p rocess of occurrence and development of the humangioma.Methods Collect 50 cases of dermal hemangioma parafliu blocks f rom the Departmengt of pathology,Renmin Hospital of Wuhan University database during the period of Sep.2005-Dec.2009,among which 25 cases are female and 25 cases are male.Adopt immuno-histochemical technology to examine the expression level of WWOX protein in 50 casesof dermal hemangioma at proliferative stage,involution stage and normal dermal tissue,then use the HPIAS-1000 Graphic report management system to quantitatively analyze the expression of WWOX protein,and apply SPSS11.5 to conduct one-variable standard variance analysis and SN K(q)test on the average optical density of positive particles in immuno-histochemical reaction and positive ratio of area.Results In hemangioma endothelial cells at proliferative stage,spot a few of brown particles with low expression level of WWOX protein.In normal tissue and hemangioma endothelial cells at involution stage,spot lots of brown particles with high expression level of WWOX protein.The expression level of WWOX protein in hemangioma endothelial cells at proliferative stage is lower than which in normal tissue and hemangioma endothelial cells at involution stage.Conclusion There may be close relations between the low level or loss of the expression of WWOX protein in hemangioma endothelial cells at proliferative stage and the processof occurrence and development of the humangioma.

Humangioma; Tumor suppressor gene; WWOX protein

R739.5

A

10.3870/zgzzhx.2011.03.017

2010-02-10

2010-04-01

國(guó)家自然科學(xué)基金資助(30872688)

靳君,男(1987年),漢族,碩士研究生。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)