李 健 郝 鈺 張玉麗 謝 偉 李 軍 薛曉鷗＊

小檗堿對(duì)CT26皮下移植瘤組織中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的影響

李 健 郝 鈺 張玉麗1謝 偉1李 軍1薛曉鷗1＊

(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,北京100029;1北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬東直門醫(yī)院婦科,北京100700)

目的 觀察小檗堿的抑瘤作用及其對(duì)腫瘤組織內(nèi)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞數(shù)量的影響。方法 BABL/c小鼠40只隨機(jī)分2組,全部皮下移植結(jié)腸癌細(xì)胞(CT26細(xì)胞系),次日進(jìn)行藥物干預(yù)。治療組小鼠腹腔注射小檗堿,100mmol/L,200μl/d,14d;對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水。腫瘤細(xì)胞接種7d后連續(xù)動(dòng)態(tài)測(cè)定腫瘤體積,接種15d處死全部動(dòng)物,取腫瘤組織、免疫組織化學(xué)顯色檢測(cè)腫瘤組織中M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206及CD68的表達(dá)。結(jié)果 小鼠皮下移植CT26后,小檗堿治療組小鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)緩慢。與對(duì)照組比較,腫瘤體積及瘤重均顯著減少(P<0.05);皮下移植15d腫瘤組織中可見大量CD206及CD68陽性細(xì)胞;腫瘤組織中CD206及CD68陽性細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P<0.05 or P<0.01)。結(jié)論 小檗堿可能通過抑制腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的形成而發(fā)揮抗腫瘤作用。

小檗堿; 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞; CT26

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與慢性炎癥關(guān)系密切。炎癥反應(yīng)可募集大量中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞進(jìn)入腫瘤組織,組成復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境。近年來的研究表明[1],腫瘤組織內(nèi)包含一種特殊類型巨噬細(xì)胞,促進(jìn)腫瘤組織血管生成、參與腫瘤浸潤(rùn)和侵襲、增加腫瘤的惡性程度,稱為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor associated macrophages,TAMs)。TAMs表型特征復(fù)雜多樣,其中巨噬細(xì)胞甘露糖受體(macrophage mannose receptor,MMR or CD206)及CD68高表達(dá)是 TAMs的主要特征[2]。已知腫瘤微環(huán)境中存在較多數(shù)量的 TAMs。TAMs不僅與癌前病變關(guān)系密切,而且參與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程[3]。臨床觀察證實(shí)[4,5,6],多種惡性腫瘤組織中均含有較大數(shù)量的 TAMs,其表達(dá)水平與腫瘤預(yù)后呈負(fù)相關(guān),干預(yù) TAMs的形成能在一定程度上抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移,是腫瘤治療的潛在“靶點(diǎn)”。

小檗堿(Berberine)又稱黃連素,是從毛茛科植物黃連 (Captis Chinensis)干燥根莖中提取的一種異喹啉類季銨生物堿,具有廣譜抗菌作用,臨床主要用于治療胃腸道疾病。近年來,小檗堿抗腫瘤活性逐漸被研究者重視。已有的研究表明[7,8]:小檗堿的抗腫瘤作用主要通過抑制相關(guān)致癌微生物、抑制癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡及調(diào)節(jié)活性氧自由基(ROS)水平等實(shí)現(xiàn)。然而小檗堿對(duì)腫瘤微環(huán)境中炎癥細(xì)胞調(diào)節(jié)及對(duì) TAMs影響的研究尚未見報(bào)道。為此本實(shí)驗(yàn)以結(jié)腸癌CT26皮下荷瘤小鼠為模型,觀察了小檗堿在體抑瘤效果及對(duì)腫瘤組織中CD68+和CD206+巨噬細(xì)胞數(shù)量、分布的影響,初步證實(shí)小檗堿對(duì) TAMs的形成具有顯著抑制作用。具體結(jié)果報(bào)告如下:

材料和方法

1.材料

SPF級(jí)BABL/c小鼠 40只(20±2g,雄性)購自中國中醫(yī)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心,動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(京2005-0004)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分2組:小檗堿治療組和溶劑對(duì)照組;小檗堿購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司;小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株(CT26)購自中國醫(yī)科院細(xì)胞所;anti-mouse CD68 antibody(clone: FA-11)、anti-mouse CD206 (clone:MR5D3)及F4/80(clone:BM8)一抗均購自Biolegend公司;通用型SP法二抗 PV-6000及AEC顯色系統(tǒng)購自北京中衫金橋生物公司;細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑、耗材購自杭州四季青生物工程材料有限公司。

2.方法

2.1 CT26細(xì)胞擴(kuò)增、計(jì)數(shù)及皮下移植 按照常規(guī)方法體外培養(yǎng)CT26細(xì)胞,收獲對(duì)數(shù)期CT26細(xì)胞,用無菌生理鹽水調(diào)細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml,每只小鼠右腋部皮下接種0.2ml。接種次日動(dòng)物隨機(jī)分2組:荷瘤模型對(duì)照組和小檗堿治療組,每組20只。

2.2 小檗堿干預(yù)方法依據(jù)已有文獻(xiàn)[9]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,小檗堿用無菌生理鹽水溶解(濃度為100mmol/L)。治療組小鼠于接種次日起腹腔注射小檗堿0.2ml,每日1次,連續(xù)給藥14d。荷瘤對(duì)照組腹腔注射生理鹽水(0.2ml/d,14d)。

2.3 腫瘤體積測(cè)量[10]接種腫瘤細(xì)胞7d后,用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量皮下腫瘤長(zhǎng)軸(L)、短軸(W)的長(zhǎng)度,每天1次。腫瘤體積(mm3)=1/2×L×W2。

2.4 腫瘤組織石蠟包埋IHC染色 接種腫瘤細(xì)胞第15d,動(dòng)物處死,仔細(xì)剝離皮下腫瘤,稱重后切取0.5cm×0.5cm大小腫瘤組織,4%多聚甲醛固定。隨后行常規(guī)石蠟包埋,石蠟切片(0.4μm),F4/80(1:100)、CD68(1:100)及 CD206(1:50)免疫組織化學(xué)染色(SP法)、AEC顯色、光鏡觀察、攝片。

2.5 圖像分析及數(shù)據(jù)處理顯 微鏡下按照5點(diǎn)采樣法攝片,應(yīng)用Image-pro Plus5.0圖像分析軟件對(duì)陽性細(xì)胞計(jì)數(shù),定量數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS11.0軟件,作單因素方差分析,兩組間比較采用Student’s-t檢驗(yàn),結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s D)表示。

結(jié) 果

1.小檗堿可顯著抑制皮下移植瘤生長(zhǎng)

動(dòng)態(tài)測(cè)量CT26皮下移植瘤體積的結(jié)果顯示,小檗堿治療組皮下腫瘤生長(zhǎng)緩慢。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,小檗堿治療14d時(shí)小鼠皮下腫瘤體積約795.8 mm3,溶劑對(duì)照組小鼠皮下腫瘤體積約 1988.9 mm3,方差分析差異顯著 (P<0.05,如圖1-A)。處死動(dòng)物后,對(duì)各小鼠皮下腫瘤進(jìn)行稱重,結(jié)果顯示,小檗堿治療組皮下腫瘤平均重量1.54g,溶劑對(duì)照組皮下腫瘤重量約3.04g,差異顯著(P<0.05,如圖1-B)。

圖1 小檗堿對(duì)BABL/c小鼠皮下接種CT26細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用Fig.1 Inhibiting effect on subcutaneous CT26 tumor in BABL/c mice by berberine

2.小檗堿顯著減少皮下移植瘤組織中CD68+及CD206+巨噬細(xì)胞的數(shù)量

光鏡下,免疫組織化學(xué)A EC顯色,陽性反應(yīng)顆粒呈紅色。結(jié)果顯示:皮下移植瘤組織中含有大量F4/80+單核細(xì)胞。圖像分析結(jié)果表明,小檗堿治療組與荷瘤模型對(duì)照組F4/80+單核細(xì)胞數(shù)量沒有顯著差異 (P>0.05,如圖2-A、2-a)。CD68及 CD206染色結(jié)果顯示,皮下移植瘤組織中含有一定數(shù)量的CD68+和CD206+巨噬細(xì)胞。圖像分析結(jié)果表明,與溶劑對(duì)照比較,小檗堿治療組皮下腫瘤組織中CD68+及CD206+巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P<0.05或 P<0.01,如圖 2-B、2-b、2-C、2-c)。

圖2 小檗堿對(duì)皮下CT26移植瘤組織內(nèi) TAMs數(shù)量影響的IHC結(jié)果Fig.2 Tumor associated macrophages in subcutaneous CT26 tumor tissue by IHC stainingA,B,C:溶劑對(duì)照組;a,b,c:小檗堿治療組;紅色示陽性細(xì)胞,其中圖A和a、C和c,100×,圖B、b,200×

討 論

巨噬細(xì)胞 (Macrophage)是人體固有免疫系統(tǒng)的重要細(xì)胞組份,起源于CD34+骨髓祖細(xì)胞,以前單核細(xì)胞的形式釋放進(jìn)入血液并移行至全身各個(gè)器官、組織,轉(zhuǎn)化成特殊的原位駐留巨噬細(xì)胞,如肝臟內(nèi)的庫普弗氏細(xì)胞(Kupffer cell)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細(xì)胞、肺塵細(xì)胞、皮膚的朗格漢斯細(xì)胞等,統(tǒng)稱“單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)”。以往的觀點(diǎn)認(rèn)為[11],巨噬細(xì)胞是人體固有免疫系統(tǒng)的重要組成成分,能直接殺傷腫瘤細(xì)胞或通過呈遞腫瘤相關(guān)抗原誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答從而間接清除腫瘤細(xì)胞。但是近年來,越來越多的證據(jù)表明[12],腫瘤微環(huán)境內(nèi)的巨噬細(xì)胞可分化為功能不同的2種類型,即 M1型和 M 2型。M2型巨噬細(xì)胞又稱為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs),不但沒有抗腫瘤作用,反而參與了腫瘤的增殖、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移等過程。TAM普遍被認(rèn)可的表型是 IL-4high/IL-10high/IL-12low以及表面標(biāo)記物 CD68、CD163、CD206等高表達(dá)[2,11,12]。本實(shí)驗(yàn)通過整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),中藥單體化合物小檗堿具有一定的抑瘤作用,同時(shí)顯著抑制腫瘤組織中 TAMs的形成。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步提示:小檗堿可能通過干預(yù)TAMs的形成而發(fā)揮抗腫瘤的作用。

早在1863年,Virchow就在惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)了炎性細(xì)胞并設(shè)想炎性環(huán)境與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切。大量研究表明[13],非甾體類抗炎藥(NSAID),特別是COX-2選擇性抑制劑具有抗腫瘤作用。Balkwill F.及Mantovani A.的研究工作則證實(shí)了Virchow的假說,指出巨噬細(xì)胞平衡假說存在大量證據(jù)支持,抗炎可能成為預(yù)防和治療腫瘤的新途徑[14]。為此從抗炎藥物中篩選抗腫瘤新藥已成為醫(yī)藥工作者關(guān)注的熱點(diǎn)。小檗堿是中藥黃連的主要活性成分,價(jià)廉、低毒,抗炎、抑菌作用明顯。黃連始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,是歷史悠久的傳統(tǒng)藥物之一,具清熱解毒之功效,在腫瘤臨床治療中應(yīng)用廣泛[15]。已有的研究主要側(cè)重黃連及小檗堿抑制腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、分化等方面?；谛￠迚A的抗炎作用,研究其對(duì)腫瘤微環(huán)境 TAMs調(diào)節(jié)作用尚屬空白。本實(shí)驗(yàn)的初步結(jié)果提示,與小檗堿類似的具有抗炎、抑菌作用的中藥提取物有望成為新型抗腫瘤藥物。本實(shí)驗(yàn)也為清熱解毒中藥抗腫瘤提供了新的證據(jù)。

綜上所述,TAMs是腫瘤發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的重要調(diào)節(jié)者。中藥提取物小檗堿能有效影響 TAMs的形成,從而抑制腫瘤的增殖。該結(jié)果初步提示:清熱解毒類中藥提取物具有潛在抗腫瘤作用,其抑制腫瘤增殖及惡性程度增加的機(jī)制與影響 TAM形成有關(guān)。

(＊致謝:本論文是在加拿大Mc Master大學(xué)分子醫(yī)學(xué)與病理系萬永紅教授的指導(dǎo)下完成的,在此向萬教授及其領(lǐng)導(dǎo)的課題組表示感謝。)

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Berberine inhibits tumor-associated macrophages in subcutaneous tumor of mice

Li Jian,Hao Yu,Zhang Yuli1,Xie Wei1,Li Jun1,Xue Xiaoou1＊
(Pre-clinical College,Beijing University of Trasitional Chinese Medicine,Beijing,100029;1Department of Gynecology of Dongzhi men Hospital,Beijing 100700,China)

Objective To observe the antitumor effect of berberine through inhibiting tumor-associated macrophages in subcutaneous tumor.Methods 40 BABL/c mice were divided into 2 groups:vehicle group and berberine treatment group.CT26 tumor cells were transplanted subcutaneously.Immunohistochemistry was used to examine tumor-associated macrophage phenotypes CD206 and CD68 in subcutaneous tumor tissue.Results Berberine inhibited tumor growth tendency remarkably(P<0.05 vs.vehicle control).The quantity of CD68+/CD206+tumor-associated macrophages were reduced significantly by berberine treatment(P<0.05 vs.vehicle control).Conclusion The anti-tumor role of berberine is achieved by inhibiting the formation tumor-associated macrophages.

Berberine; Tumor-associated macrophage; CT26

R285.5

A

10.3870/zgzzhx.2011.03.001

2010-11-15

2011-04-01

國家科技支撐項(xiàng)目(2006BAI11B07-02);國家自然科學(xué)基金資助(30873268)

李健,男(1970年),漢族,副教授,碩士生導(dǎo)師。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)