劉 巍，謝笑龍，劉 旭，王智新

(1．貴州航天醫(yī)院 婦產(chǎn)科，貴州 遵義 563003;2．遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義 563000)

銀杏外種皮多糖對人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1B增殖的影響

劉 巍1，謝笑龍2，劉 旭1，王智新1

(1．貴州航天醫(yī)院 婦產(chǎn)科，貴州 遵義 563003;2．遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義 563000)

目的 觀察銀杏外種皮多糖(GBEP)對人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1B增殖的影響。方法 體外培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞 HEC-1B，血清饑餓24 h后，用不同濃度(0，40，80，160 mg/L)的 GBEP 作用24，48，72 h，用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的增殖周期。結(jié)果 GBEP抑制人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1B增殖的作用呈時(shí)間、劑量依賴性;作用72 h后，HEC-1B細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞增多，G2/M期細(xì)胞較對照組也增多(P＜0．05)。結(jié)論 GBEP對子宮內(nèi)膜癌HEC-1B細(xì)胞的增殖有抑制作用，與引起細(xì)胞周期阻滯有關(guān)。

銀杏外種皮多糖;子宮內(nèi)膜癌;細(xì)胞周期

子宮內(nèi)膜癌是起源于子宮內(nèi)膜腺體的惡性腫瘤，又稱子宮體癌，是女性生殖器三大惡性腫瘤之一，好發(fā)于絕經(jīng)后老年女性，占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%。子宮內(nèi)膜癌以手術(shù)治療為主，化療已成為術(shù)后首選后續(xù)治療方案。銀杏是中華國寶，銀杏葉的藥用價(jià)值已令世人矚目［1］。而國內(nèi)外對銀杏外種皮的研究卻甚少，大量的外種皮被廢棄，造成資源浪費(fèi)，環(huán)境污染［2］。銀杏外種皮多糖(Ginkgo biloba endocarp polysaccharides，GBEP)是從銀杏的外種皮中提得的活性多糖，已有研究表明其對胃癌、肺癌、肝癌及宮頸癌細(xì)胞具有一定的抑制效果［3］。本研究通過觀察GBEP對人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1B增殖的影響，為銀杏外種皮的進(jìn)一步開發(fā)利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 儀器及試劑

F50型光吸收酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司;DMILPH1型倒置相差顯微鏡，德國Leika公司;Gallios型流式細(xì)胞儀，美國Beckman Coulter公司。

細(xì)胞培養(yǎng)用試劑，美國Gibco公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)，美國Sigma公司;二甲亞砜(DMSO)，北京鼎國生物技術(shù)有限公司。

1．2 細(xì)胞株及培養(yǎng)方法

人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1B(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫)接種于培養(yǎng)瓶，加入含10%小牛血清、100 u/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中，待生長至80%融合時(shí)，棄培養(yǎng)基，加入0．25%胰蛋白酶溶液和0．02%乙二胺四乙酸溶液(1∶1)混合消化液傳代;臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞存活率＞95%時(shí)用于實(shí)驗(yàn)［4］。

1．3 GBEP 的制備

取銀杏外種皮(采集貴州遵義的成熟銀杏果實(shí)，去除白果后得到外種皮)適量，置于圓底燒瓶中，按一定料液比、水浴溫度、浸提時(shí)間，在熱水浴中回流浸提數(shù)次，冷卻后過濾，合并上清液;上述清液經(jīng)減壓濃縮，加入一定體積95%乙醇，使終濃度為80%，靜置沉淀，所得沉淀依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌，真空干燥后得GBEP粉末(多糖含量為6．68%)［5］。

1．4 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力

將對數(shù)生長期的HEC-1B細(xì)胞用培養(yǎng)基調(diào)整濃度為4 ×104個(gè)/mL，以 100 μL/孔接種于 96 孔板中，置于培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞饑餓;分組加藥，分別將含40，80，160 mg/L GBEP的培養(yǎng)基10 μL加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，每個(gè)濃度做6復(fù)孔，設(shè)立空白對照組，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)44 h。每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，孵育 4 h，每孔加入 DMSO 150 μL振動15 min，用酶標(biāo)儀測定570 nm波長處的吸光度(A)值，計(jì)算抑制率［6］。抑制率 =(1－A實(shí)驗(yàn)組/A對照組) ×100%。

1．5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖周期

各濃度GBEP作用于細(xì)胞72 h后，消化并收集細(xì)胞，每管中含1×106細(xì)胞，1 500 r/min離心2 min，棄上清，沿管壁緩慢加入4℃預(yù)冷的70%乙醇，重懸后4℃固定過夜，次日1 800 r/min離心5 min，棄上清，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，加入RNase A抑制劑20 μL，37℃水浴30 min，加入 PI染色液吹打均勻，4℃避光30 min，上機(jī)檢測細(xì)胞周期［7］。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS16．0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)以(x±s)表示，各濃度組間采用兩兩比較方差分析法(LSD法)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率

結(jié)果見表1。同一藥物濃度組分別作用24，48，72 h后，以72 h抑制率最高(P＜0．05);同一時(shí)間點(diǎn)，不同濃度組，以160 mg/L組抑制率最高(P＜0．05)。

2．2 流式細(xì)胞檢測細(xì)胞增殖周期

結(jié)果見表2。40～160 mg/L的GBEP作用于細(xì)胞72 h后，G0/G1期細(xì)胞比例明顯增多(P＜0．05)，S期細(xì)胞比例變化不明顯;G2/M期細(xì)胞比例明顯減少(P ＜0．05)。

表1 不同濃度GBEP作用不同時(shí)間對人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1B的增殖抑制作用(n=6)

表2 GBEP對人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1B增殖周期的影響(n=6)

3 討論

子宮內(nèi)膜癌術(shù)后常用的化療藥物有阿霉素、鉑類、環(huán)磷酰胺、紫杉醇等，聯(lián)合化療的效果優(yōu)于單藥化療，但是副作用較大。從天然植物中提煉出與癌癥發(fā)生、發(fā)展、形成等過程中各調(diào)節(jié)靶點(diǎn)特異結(jié)合的活性成分，已成為當(dāng)前抗癌新藥研究的熱點(diǎn)。

本研究進(jìn)一步觀察GBEP對人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1B增殖的影響，結(jié)果顯示，40～160 mg/L的GBEP呈時(shí)間、劑量依賴性抑制HEC-1B細(xì)胞的增殖;G0/G1期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例變化不明顯，而G2/M期細(xì)胞比例減少?？赡軝C(jī)制為細(xì)胞周期的調(diào)控是通過細(xì)胞周期關(guān)卡實(shí)現(xiàn)的，包括G1期關(guān)卡、S期關(guān)卡和G2期關(guān)卡，這三個(gè)關(guān)卡在DNA復(fù)制和有絲分裂前負(fù)責(zé)確定DNA合成的完整性，監(jiān)控DNA的復(fù)制、DNA損傷修復(fù)。子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞在增殖過程中關(guān)卡失控，使本來應(yīng)停止增殖或發(fā)生凋亡的細(xì)胞，其DNA損傷及復(fù)制錯(cuò)誤未能糾正，從而使細(xì)胞不停地進(jìn)入細(xì)胞周期造成惡性增生。GBEP可能對HEC-1B細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期有抑制作用，而抑制DNA合成，使細(xì)胞周期停滯在G1期，對細(xì)胞增殖起到抑制作用?？傊?，GBEP對子宮內(nèi)膜癌HEC-1B細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，其機(jī)制與引起細(xì)胞周期阻滯有關(guān)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

［1］ 崔曉雪，顧 曄．銀杏葉提取物對自發(fā)性高血壓大鼠血管外膜成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響［J］．中國生化藥物雜志，2011，32(4):313-315．

［2］ 許愛華，陳華圣，陳 鋼，等．銀杏外種皮多糖對SGC-7901細(xì)胞p53基因的表達(dá)及端粒酶活性的影響［J］．中國藥理學(xué)通報(bào)，2003，19(10):1174-1176．

［3］ 許愛華，陳華圣，孫步蟾．銀杏外種皮多糖對HL-60細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)研究［J］．中藥材，2004，27(5):361-363．

［4］ 王艷麗，崔金全，李華萍，等．蘇拉明對人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和乙酰肝素酶表達(dá)的影響［J］．腫瘤基礎(chǔ)與臨床，2008，21(3):198-201．

［5］ 楊 濱，婁曉明，吳春麗，等．銀杏外種皮多糖對人宮頸癌細(xì)胞系Siha增殖及侵襲的影響［J］．實(shí)用藥物與臨床，2011，14(3):179-181．

［6］ 都紅蕾，孫奮勇，陳 勍，等．肝細(xì)胞生長因子對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］．廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，24(3):294-297．

［7］ 鄭軍生，周 潔，李小毛，等．亞硒酸鈉對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖能力的影響［J］．中國病理生理雜志，2011，27(12):2258-2264．

The effects of ginkgo biloba exocarp polysaccharides on proliferation of human endometrial cancer cell HEC-1B

LIU Wei1，XIE Xiao-long2，LIU Xu1，WANG Zhi-xin1
(1．The Obstetrics and Gynecology Department，Guizhou Aerospace Hospital，Zunyi 563003，China;2．School of Pharmacy，Zunyi Medical University，Zunyi 563000，China)

R737．3;R285．5

A

1005-1678(2012)06-0841-03

2012-07-26

劉 巍，副主任醫(yī)師，研究方向:婦科腫瘤治療，Tel:0852-8693056。