劉振茹，凌保東，2△

(1.川北醫(yī)學(xué)院藥物研究所，四川 南充 637007;2.成都醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610500)

鮑曼不動桿菌耐藥性與16S rRNA甲基化酶基因表達相關(guān)性研究

劉振茹1，凌保東1，2△

(1.川北醫(yī)學(xué)院藥物研究所，四川 南充 637007;2.成都醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610500)

目的:了解鮑曼不動桿菌對臨床常用藥物耐藥性與16S rRNA甲基化酶基因表達水平之間的相關(guān)性。方法:從2008年9月至2011年1月收集的110株鮑曼不動桿菌，瓊脂二倍稀釋法測定其對21種藥物(包括6種氨基糖苷類藥物)的敏感性。PCR法檢測7種甲基化酶基因(armA、rmtA-rmtE、npmA)，RT-PCR檢測甲基化酶基因armA的mRNA表達水平。結(jié)果:鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類的耐藥率在58.2%～83.8%之間，且MIC值多在512.0 μg/mL以上。對多粘菌素B敏感率100%，其余藥物耐藥率在43.6%～93.6%之間。armA基因檢出率為36.4%(40株)，其余基因未檢出。RT-PCR結(jié)果顯示，armA基因在高水平耐氨基糖苷菌株中有mRNA的表達。結(jié)論:鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類藥物的高度耐藥性與16S rRNA甲基化酶基因的表達有關(guān)。

鮑曼不動桿菌;16S rRNA甲基化酶;RT-PCR

近年來有學(xué)者將常見的多重耐藥菌歸為“ESKAPE”病原菌，其中“A”即代表鮑曼不動桿菌［1－2］。該菌也在近十年來逐漸成為常見的醫(yī)院內(nèi)感染非發(fā)酵革蘭陰性桿菌［3］，作為一種重要的條件致病菌，以其高檢出率和高耐藥率越來越引起高度關(guān)注［4］。

鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類藥物的高水平耐藥逐漸成為研究熱點。16S rRNA甲基化酶作為一種新型耐藥機制，它可以介導(dǎo)對氨基糖苷類藥物的高水平耐藥。MIC值往往高達512.0～1 024.0 μg/mL［5］。迄今已發(fā)現(xiàn)7種甲基化酶基因，呈現(xiàn)出全球性的播散趨勢［6－12］。

為了解川東北地區(qū)鮑曼不動桿菌臨床分離株甲基化酶基因的存在情況，探討它們的存在與表達在氨基糖苷類藥物高水平耐藥中的作用，本實驗通過PCR法檢測7種甲基化酶基因(armA、rmtA-rmtE、npmA)，并運用RT-PCR檢測armA mRNA的表達水平，分析其與耐藥性間的關(guān)系，以期為了解鮑曼不動桿菌耐藥性的形成及臨床醫(yī)師合理應(yīng)用抗菌藥物提供實驗室依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源收集2007年9月至2011年1月川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和附屬南充市中心醫(yī)院臨床分離的非重復(fù)鮑氏不動桿菌110株，菌株均經(jīng)法國Bio-Merieux公司Vitek32全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定。

1.1.2 質(zhì)控菌株銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希菌ATCC25922由四川抗生素工業(yè)研究所提供，鮑氏不動桿菌標準菌株ATCC19606購自美國ATCC菌種庫。

1.1.3 抗菌藥物慶大霉素購自宜昌人福藥業(yè)有限責任公司;鏈霉素購自山東魯抗藥業(yè)股份有限公司;阿米卡星購自江蘇吳中實業(yè)股份有限公司;妥布霉素、卡那霉素、奈替米星、加替沙星均購自上海信然實業(yè)有限公司;頭孢西丁購自深圳信立泰藥業(yè)有限公司;頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢哌酮購自哈藥集團制藥總廠;頭孢吡肟購自山東羅欣藥業(yè)股份有限公司;諾氟沙星購自河南康泰制藥集團公司;左氧氟沙星購自山西威奇達藥業(yè)藥業(yè)有限公司;氯霉素購自南京白敬宇制藥公司;氨曲南購自山西威奇達藥業(yè)藥業(yè)有限公司;四環(huán)素購自上海生物工程技術(shù)有限公司;米諾環(huán)素購自地奧集團成都藥業(yè)股份有限公司;美羅培南購自住友制藥株式社;環(huán)丙沙星、亞胺培南、多粘菌素B均購自Sigma公司。

1.1.4 化學(xué)試劑First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒:TOYOBO公司;2×Taq PCR MasterMix、DNA Marker、DNA純化回收試劑盒(離心柱型)、總RNA提取試劑盒(離心柱型)、溶菌酶、DEPC:北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗采用瓊脂二倍稀釋法測定21種抗菌藥物對110株鮑氏不動桿菌的最低抑菌濃度(MIC);結(jié)果判定參照2010年CLSI(clinical and laboratoy standards institue，CLSI)公布標準，以敏感(S)、中介(I)、耐藥(R)記錄實驗結(jié)果。

1.2.2 PCR擴增甲基化酶基因以阿米卡星MIC≥256 μg/mL，將110株細菌分為氨基糖苷類高水平耐藥組(60株)和相對低水平耐藥組(50株)。挑取單個菌落于25 μL無菌水中，95℃15 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液作為模板。委托上海生工設(shè)計與合成引物，PCR反應(yīng)體系及條件如下:2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物分別為1 μL，模板DNA2 μL，超輕水(DDW)8.5 μL，共25 μL，稍離心混勻。94℃預(yù)變性5 min，循環(huán)參數(shù)為:94℃變性l min，退火30 s，72℃延伸l min，共進行30℃次循環(huán)，72℃延伸7 min。純水為空白對照。退火溫度通過梯度PCR方法確定，除擴增armA時用58℃外，其余均使用55℃。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果，并照相。

1.2.3 RT-PCR檢測甲基化酶armA基因mRNA水平表達(1)提取細菌總RNA:取1 mL菌液離心留沉淀，加入TE緩沖液(pH8.0)含有0.8 μL溶菌酶(50.0 mg/mL)100 μL吹打混勻，孵育3～5 min。加入350 μL裂解液RL，漩渦振蕩混勻，離心2 min，取上清液轉(zhuǎn)移至離心管中。加入250 μL無水乙醇，混勻，轉(zhuǎn)入吸附柱CR3中，離心棄廢液，加350 μL去蛋白液RW1，離心棄廢液，加80 μL的DNase I工作液于吸附柱中CR3中，室溫靜置約15 min。加入350 μL去蛋白液RW1，離心棄廢液，加500 μL去漂洗液RW(已加入乙醇)，室溫放置2 min，離心棄廢液，室溫放置數(shù)分鐘。將吸附柱CR3轉(zhuǎn)入新的RNase-free離心管中，懸空滴加35 μL RNase-free ddH2O，室溫放置2 min，12 000 rpm離心2 min，得到RNA溶液。(2)RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA:操作均在冰上制備:取總RNA 0.1～1 μg，1 μL隨機引物，RNasefree ddH2O配制成12 μL混合物，稍離心，65℃孵育5 min，立即冰上冷卻即為變性RNA溶液。加樣順序，取變性后RNA溶液12 μL，5×RT buffer 4 μL，10mM dNTP Mixture 2 μL，RNase Inhibitor1 μL，Rever Tra Ace 1 μL，總體積為20 μL，瞬時離心。按以下條件進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，30℃孵育10 min，42℃孵育20 min，99℃孵育5 min，4℃5 min終止反應(yīng)。(3)PCR擴增:目的基因分別用表1中引物armAP1/P2，AdeB-P1/P2，16SrRNA-P1/P2進行PCR擴增，擴增體系及條件:2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物分別為1 μL，模板cDNA 2 μL，超輕水(DDW)8.5 μL，共25 μL，稍離心混勻。循環(huán)參數(shù)設(shè)置同前。擴增結(jié)束后用2%瓊脂糖凝膠電泳進行分離并觀察PCR產(chǎn)物。

表1 鮑曼不動桿菌PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

顯著性比較采用SPSS13.0軟件進行t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗結(jié)果

110株鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類的耐藥率在50.1%～83.8%之間，對多粘菌素B最敏感，敏感率為100%，其次為亞胺培南和美羅培南，耐藥率分別為8.2%和9.1%，其余藥物耐藥率在43.6%～93.6%之間，耐藥情況嚴重(表2)。

表2 21種抗菌藥物對鮑曼不動桿菌的體外活性(n=110)

鮑曼不動桿菌氨基糖苷類藥物MIC值構(gòu)成比。對氨基糖苷類耐藥的菌株其MIC值較高，多在256.0 μg/mL及以上，對該類抗生素呈現(xiàn)較高水平的耐藥性，其MIC≥256.0 μg/mL的比例在46.4%～65.4%之間(表3)。

表3 6種氨基糖苷類抗生素MIC值(≥256 μg/mL)百分比

2.2 16s rRNA甲基化酶基因檢測結(jié)果

在對氨基糖苷類高水平耐藥組中，66.7%的菌株(40/60)檢測到armA，其余6種甲基化酶基因未檢出。而在低水平耐藥組中7種甲基化酶基因均未檢出。部分陽性結(jié)果，見圖1。

2.3 RT-PCR結(jié)果

在高水平耐藥組中，armA基因擴增陽性的菌株選用6個樣本，由于相對低水平耐藥組中armA檢測為陰性結(jié)果，因此未對低水平組進行本步操作。結(jié)果顯示在高水平耐藥組中全部擴增出與目的基因和16S內(nèi)參照基因條帶大小相似的片段，利用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描并照相，由于armA基因只在對氨基糖苷類藥物高水平耐藥組中表達，故未對其進行灰度值掃描和統(tǒng)計分析，結(jié)果見圖2。

3 討論

鮑曼不動桿菌已經(jīng)成為引起院內(nèi)感染重要的病原菌之一。我們檢測了鮑曼不動桿菌對21種抗菌藥物的耐藥情況，從藥敏結(jié)果來看，其對氨基糖苷類藥物的耐藥率均在50%以上，對阿米卡星的耐藥率最低為50.1%，高于國外學(xué)者Adams等［13］報道的阿米卡星耐藥率為36.7%，這可能與國內(nèi)外抗生素使用習(xí)慣差異等因素有關(guān)，本研究還發(fā)現(xiàn)對6種氨基糖苷類藥物的MIC≥256.0 μg/mL的百分比較高，在46.4%～65.4%之間，呈現(xiàn)出較高水平的耐藥。對頭孢菌素類、氟喹諾酮類、氯霉素的耐藥情況也相當嚴重，對碳青霉烯類亞胺培南、美洛培南的耐藥較低，耐藥率分別為為8.2%和9.1%，但多粘菌素B表現(xiàn)出最好的抗菌活性，敏感率為100%，這說明本地區(qū)鮑曼不動桿菌耐藥性嚴重，尤其對氨基糖苷類藥物多呈現(xiàn)高水平耐藥，提示在臨床用藥前應(yīng)做藥敏試驗，合理使用或聯(lián)合用藥，以期對鮑曼不動桿菌感染性疾病得到有效治療。

研究顯示鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類耐藥的主要原因是產(chǎn)生了氨基糖苷鈍化酶［14］，可將其分為乙酰轉(zhuǎn)移酶(AAC)、核苷轉(zhuǎn)移酶(ANT)和磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)三類共30余種。由于其編碼產(chǎn)生的酶底物特異性各不相同，一般只能介導(dǎo)一種或幾種結(jié)構(gòu)相似的氨基糖苷類抗生素耐藥性的產(chǎn)生［15］。如AAC(6')-I作用底物為卡那霉素、妥布霉素、奈替米星、阿米卡星及新霉素等;ANT(3″)-Ⅰ介導(dǎo)鏈霉素及壯觀霉素耐藥;APH(3')-Ⅵ可修飾大多數(shù)的氨基糖苷類藥物［16］。而質(zhì)粒介導(dǎo)的16S rRNA甲基化酶是一種較新的耐藥機制，能夠使細菌對4，6-二取代基脫氧鏈霉胺類氨基糖苷抗生素高水平耐藥。如耐卡那霉素、妥布霉素、阿米卡星、阿貝卡星、慶大霉素、西梭米星及異帕米星［17］。

本研究首次報道了川東北地區(qū)鮑曼不動桿菌產(chǎn)16S rRNA甲基化酶基因的流行現(xiàn)狀。有文獻報道［18］如果選用氨基糖苷類藥物的MIC值，其MIC值為256.0 μg/mL可提供較好的陽性預(yù)測價值，單用阿米卡星可達到60%，如果加用阿貝卡星可使其陽性預(yù)測值＞90%。由于阿貝卡星難以得到，因此我們采用以阿米卡星MIC≥256.0 μg/mL將110株鮑曼不動桿菌分為氨基糖苷類高水平耐藥組(60株)和低水平耐藥組(50株)，我們觀察到在60株高水平耐藥鮑曼不動桿菌中有40株細菌檢出armA基因，陽性率66.7%，與潘樹根等［19］的研究結(jié)果相似，介導(dǎo)了對6種氨基糖苷類藥物的高度耐藥(MIC≥512.0 μg/mL)，在阿米卡星MIC≥512.0 μg/mL的菌株中，大部分都存在armA基因，這與周穎杰等［20］的研究結(jié)果相符。另外，我們在高水平耐藥組選用6株armA基因陽性菌株進行RT-PCR分析其mRNA表達情況，結(jié)果顯示在高水平耐藥組中，armA基因在6株細菌中mRNA均有表達，這也進一步說明了16S rRNA甲基化酶的產(chǎn)生可導(dǎo)致對氨基糖苷類產(chǎn)生較高水平的耐藥。

［1］Rice LB.Federal funding for the study of antimicrobial resistance in nosocomial pathogens:no ESKAPE［J］.J Infect Dis，2008，197(8):1079－1081

［2］Boucher HW，Talbot GH，Bradley JS，et al.Bad bugs，no drugs:no ESKAPE!［J］.Clin Infect Dis，2009，48(1):1－12

［3］凌保東.鮑曼不動桿菌抗生素多重耐藥性:耐藥機制與感染治療對策［J］.中國抗生素雜志，2010，35(4):241－254

［4］奚俊，應(yīng)春妹.耐氨基糖苷類抗生素鮑曼不動桿菌中armA和rmtB甲基化酶基因的檢測［J］.中國感染與化療雜志，2010，10(3):209－212

［5］潘韻峰，周華，俞云松.導(dǎo)致高水平氨基糖苷類抗生素耐藥的新型16s rRNA甲基化酶研究進展［J］.中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2007，30(6):699－701

［6］Yamane K，Doi Y，Yokoyama K，et al.Genetic environments of the rmtA gene found in Pseudomonas aeruginosa clinieal isolates［J］.Antimierob Agents Chemother，2004，48(6):2069－2074

［7］Beauclerk AA，Cundliffe E.Sites of action of two ribosomal RNA methylases responsible for resistance to aminoglycosides［J］.J Mol Biol，1987，193(4):667－671

［8］Doi Y，Yokoyama K，Yamane K，et al.Plasmid-mediated 16s rRNA methylase in Serratia marcescens conferring high-level resistance to aminoglycosides［J］.Antimicrob Agents Chemother，2004，48(2):491－496

［9］Wachino J，Yamane K，Shibayama K，et al.Novel plasmid-mediated 16s rRNA methylase，Rmtc，found in a Proteus mirabilis isolate demonstating extraordinary high-level resistance against various aminoglycosides［J］.Antimicrob Agents Chemother，2006，50(1):178－184

［10］Doi Y，Garcia DO，Adams J，et al.Paterson DL.Co-production of novel 16s rRNA methylase RmtD and metallo-b-lactamase SPM-1 in a panresistant Pseudomonas aeruginosa from Brazil［J］.Antimicrob Agents Chemother，2006，51(3):852－856

［11］Wachino J，Shibayama K，Kurokawa H，et al.Novel plasmid-Mediated 16s rRNA m1A1408 methyltransferase，NpmA，found in a clinically isolated Escherichia coli strain resistant to structurally diverse aminoglycosides［J］.Antimicrob Agents Chemother，2007，51(12):4401－4409

［12］Davis MA，Baker KN，Orfe LH，et al.Discovery of a gene conferring multiple-aminoglycoside resistance in Escherichia coli［J］.Antimicrob Agents Chemother，2010，54(6):2666－2669

［13］Adams HJ，Paterson D，Sidjabat H，et al.Genetic Basis of Multidrug Resistance in Acinetobacter baumannii Clinical Isolates at a Tertiary Medical Center in Pennsylvani［J］.Antimicrob Agents Chemother，2008，52(11):3837–3843

［14］Mingeot－Leclercq MP，Glupczynski Y，Tulkens PM，et al.Aminoglycosides:activity and resistance［J］.Antimicrob Agents Chemother，1999，43(4):727－737

［15］Yokoyama K，Doi Y，Yamane K，et al.Acquisition of 16s rRNA methylase gene in Pseudomonas aeruginosa［J］.Lancet，2003，362(9399):1888－1893

［16］Shaw KJ，Rather PN，Hare RS，et al.Molecular genetic of aminoglycosides resistance genes and familial relationship of aminoglycoside modifying enzyme［J］.Microbiol Rev，1993，57(1):138－163

［17］吳瓊，倪語星.一種新的氨基糖苷類耐藥決定因子:質(zhì)粒介導(dǎo)的16s rRNA甲基化酶［J］.微生物與感染，2009，4(1):45－58

［18］Lee H，Yong D，Yum JH，et al.Dissemination of 16S rRNA methylase-mediated highly amikacin-resistant isolates of Klebsiella pneumoniae and Acinetobacter baumannii in Korea［J］.Diagn Microbiol Infect Dis，2006，56(3):305－312

［19］潘樹根，唐希才，唐曉華.鮑曼不動桿菌中16s rRNA甲基化酶基因的檢測［J］.廣州醫(yī)藥，2010，41(4):56－58

［20］周穎杰，余慧，郭慶蘭，等.16S rRNA甲基化酶在氨基糖苷類抗生素耐藥革蘭氏陰性菌中的分布［J］.中華感染與化療雜志，2010，10(5):363－367

Study on the correlation between antibiotic resistance and 16SrRNA methylase in acinetobacter baumannii

LIU Zhen-ru1，LING Bao-dong1，2△
(1.Institute of Materia Medica，North Sichuan Medical College，Nanchong 637007;2.Chengdu Medical College，Chengdu 610500，Sichuan，China)

Objective:To survey the the correlation between antibiotic resistance and 16SrRNA methylase in Acinetobacter baumannii.MethodsA total of 110.Acinetobacter baumanii isolates were collected from September 2008 to January 2011 in Northeastern Sichuan.The sensitivity of the isolates to 21 commonly used antimicrobial agents was determined by using agar dilution method.The 16S rRNA methylase genes(armA，rmtA-rmtE，and npmA)were analyzed by polymerase chain reaction(PCR).Using RT-PCR methord to determin the mRNA expressions of genes in some strains，and analyze the difference of mRNA expression level.Results:Of the 110 Acinetobacter baumannii isolates，58.2～83.8%of isolates were highly resistant to aminoglycoside(MIC＞512.0μg/mL)，All of the isolates(100%)were sensitive to Polymyxin B.The resistant rates to other commonly used durgs were variable(range 43.6%～93.6%).The armA gene were present in 36.4%of the 110 clinical isolates，the rest was not detected.It was shown by RT-PCR that in the high-level resistance group the selected strains were amplified with armA.ConclusionThe 16S rRNA methylase armA gene was relative to the high-level resistance to aminoglycosides inancein Acinetobacter baumannii.

Acinetobacter baumannii;16S rRNA methylase;RT-PCR

1005-3697(2012)06-0526-05

R378;R978.1+2

A

10.3969/j.issn.1005-3697.2012.06.001

國家自然科學(xué)基金資助項目(30973662)

2012-10-02

劉振茹(1985－)，女，河北石家莊人，博士研究生，主要從事細菌耐藥分子機制研究。

△通訊作者:凌保東，E-mail:baodongling@yahoo.com.cn網(wǎng)絡(luò)出版時間:2012-11-1217∶16

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20121112.1716.023.html