張延平 張曉強(qiáng) 劉雅莉 黃瑋 孫玉蕊

1 中國(guó)人民解放軍第309醫(yī)院耳鼻咽喉科(北京 100091)； 2 河南省醫(yī)學(xué)情報(bào)研究所； 3 河南省衛(wèi)生廳

GJB2基因位于染色體13q12，編碼縫隙連接蛋白26(Connxin 26, Cx26)，是構(gòu)成細(xì)胞間縫隙連接(gap junction)的重要組成部分。Cx26在哺乳動(dòng)物耳蝸中廣泛存在，它所構(gòu)成的純合縫隙連接和雜合縫隙連接在維持耳蝸正常生理功能中起重要作用。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)該基因突變是導(dǎo)致人類非綜合征型聾(nonsyndromic sensorineural hearing impairment,NSHI)的主要原因之一。目前已經(jīng)報(bào)導(dǎo)的人類GJB2突變已經(jīng)超過(guò)120種，其中絕大多數(shù)為功能喪失性突變[1]。為了探討GJB2突變導(dǎo)致耳聾的機(jī)制，研究者先后報(bào)道了三種GJB2條件敲除小鼠的動(dòng)物模型，即Cx26loxP/loxP OtogCre[2], Cx26loxP/ loxP Pax2-Cre和Cx26loxP/loxP foxg1-Cre小鼠[3]。上述三種動(dòng)物都是耳蝸中特異性缺失Cx26表達(dá)，動(dòng)物出生時(shí)內(nèi)耳發(fā)育正常，毛細(xì)胞在聽(tīng)覺(jué)開始后不久出現(xiàn)死亡，聽(tīng)覺(jué)發(fā)育成熟后出現(xiàn)耳聾，經(jīng)檢測(cè)，凋亡相關(guān)蛋白caspase 3在P17時(shí)的動(dòng)物耳蝸細(xì)胞中表達(dá)陽(yáng)性，提示凋亡可能是毛細(xì)胞死亡的主要原因[2]。上述研究主要關(guān)注整個(gè)耳蝸的細(xì)胞死亡情況，并沒(méi)有詳細(xì)探討外毛細(xì)胞的凋亡情況。因此本研究利用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)鰲和的鬼筆環(huán)肽(phalloidin )和碘化丙啶(propidium iodide，PI)聯(lián)合染色技術(shù)，研究GJB2基因條件敲除小鼠聽(tīng)覺(jué)發(fā)育成熟前后不同時(shí)期的基底膜毛細(xì)胞變化情況，為進(jìn)一步研究凋亡在敲基因動(dòng)物耳聾發(fā)病中的作用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 GJB2基因條件敲除小鼠cCx26loxp/loxp-Pax2-Cre(cCx26ko)由轉(zhuǎn)基因小鼠Cx26loxp/loxp與 Cx26loxp/--Pax2-Cre小鼠(均由美國(guó)Emory大學(xué)林曦教授實(shí)驗(yàn)室提供)雜交獲得，野生型BALB/c小鼠作為正常對(duì)照，動(dòng)物統(tǒng)一編號(hào)，統(tǒng)一喂養(yǎng)，雙盲法測(cè)定，分別選取P8、P14、P18和P21四個(gè)發(fā)育階段各6只小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，出生后第3天剪鼠尾提取基因組DNA確定基因型(方法及結(jié)果略)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 磷酸鹽緩沖液(PBS，Merk, 德國(guó))、多聚甲醛(Merk, 德國(guó))、Triton X-100(Sigma，美國(guó))、FITC-conjugated phalloidin (Enzo, 法國(guó))，PI(Sigma，美國(guó))，F(xiàn)luoromount-GTM(SouthBiotech, 美國(guó))，解剖顯微鏡(Olympus，日本)、激光共聚焦顯微鏡(LSM 510，Zeiss, Jena,德國(guó)) 等。

1.3 耳蝸基底膜鋪片 動(dòng)物用戊巴比妥腹腔注射麻醉后，斷頭取耳蝸，在解剖顯微鏡下，用分離針將蝸尖挑開一小孔，挑破圓窗膜，取出鐙骨，用細(xì)玻璃吸管將4%多聚甲醛由蝸尖小孔灌注，使固定液經(jīng)前庭階、鼓階從前庭窗和圓窗流出，然后將標(biāo)本放入該固定液里4 ℃冰箱內(nèi)固定過(guò)夜。10% EDTA充分脫鈣，在冰PBS中將骨迷路去除，解剖出耳蝸基底膜，分為底、中、頂三段，進(jìn)行后續(xù)染色。

1.4 FITC- phalloidin 和PI染色 耳蝸基底膜經(jīng)0.25% Triton X-100漂洗5 min， 浸泡于新鮮配置的 FITC- phalloidin 染液中染色30 min ，標(biāo)記靜纖毛和毛細(xì)胞表皮板，經(jīng)PBS漂洗3次后，再用PI (10 μg/ml) 復(fù)染 10 min，標(biāo)記細(xì)胞核，再次用PBS漂洗后，抗熒光衰減封片劑 Fluoromount-GTM封片。熒光顯微鏡下觀察毛細(xì)胞的變化，激光共聚焦顯微鏡拍照，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 野生型BALB/c小鼠耳蝸染色結(jié)果 熒光顯微鏡下可見(jiàn)，野生型BALB/c小鼠耳蝸出生后各階段被綠色異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色的毛細(xì)胞肌動(dòng)蛋白主要分布在毛細(xì)胞的纖毛和表皮板。外毛細(xì)胞排列整齊，纖毛呈V型排列,表皮板完好,結(jié)構(gòu)正常。被PI染色的毛細(xì)胞核大小一致，染色均勻，外形規(guī)則，排列有序，無(wú)細(xì)胞核缺失(圖1b)。

2.2 cCx26小鼠耳蝸基底膜染色結(jié)果 熒光顯微鏡下，P8時(shí)cCx26小鼠耳蝸形態(tài)與相應(yīng)時(shí)期野生型BALB/c小鼠耳蝸形態(tài)無(wú)明顯差異(圖1a1)。P14時(shí)cCx26小鼠表皮板開始稀松，外毛細(xì)胞(outer hair cells, OHC)核排列開始出現(xiàn)不規(guī)則，有些細(xì)胞有核染色加深現(xiàn)象，但尚未出現(xiàn)明顯的表皮板缺損和核形態(tài)異常(圖1a2 )。在P18時(shí)，耳蝸的表面形態(tài)在熒光顯微鏡下出現(xiàn)明顯的變化，OHC 核出現(xiàn)固縮、染色濃集、體積變小、核碎裂成片斷化，甚至核缺失(圖2)。FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色的毛細(xì)胞可見(jiàn)散在性的纖毛結(jié)構(gòu)模糊,表皮板塌陷，將肌動(dòng)蛋白染色與毛細(xì)胞核染色同部位檢查,毛細(xì)胞核輕微固縮時(shí)其表皮板和纖毛結(jié)構(gòu)及染色大致正常,僅在毛細(xì)胞核明顯固縮時(shí)出現(xiàn)表皮板變形和塌陷，提示此時(shí)外毛細(xì)胞周圍的支持細(xì)胞，如Dieter細(xì)胞，也開始出現(xiàn)了零星的破壞。上述變化在中回最為明顯(圖2b)，其次為底回(圖2c)，而頂回(圖2a)只是出現(xiàn)OHC的形態(tài)不規(guī)則，并沒(méi)有明顯的核的破壞或消失。在P21時(shí)，耳蝸表面結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了更為嚴(yán)重的破壞，整個(gè)耳蝸都出現(xiàn)了OHC的缺失，中回的破壞最為嚴(yán)重，甚至出現(xiàn)了基底膜的片斷化斷裂和缺失，提示OHC和支持細(xì)胞都出現(xiàn)了缺失 (圖1a3)。與野生型小鼠相比, cCx26ko小鼠各階段內(nèi)毛細(xì)胞纖毛染色不規(guī)則，深淺不一，細(xì)胞核未見(jiàn)明顯形態(tài)異常及缺失。

圖1 小鼠耳蝸基底膜染色結(jié)果(×400)

a1～3為cCx26ko小鼠不同階段基底膜染色結(jié)果，b1～3為野生型小鼠基底膜染色結(jié)果。P8時(shí)cCx26ko小鼠(a1，中回)與野生型小鼠(b1)相比未見(jiàn)明顯差異，P14時(shí)cCx26ko表皮板出現(xiàn)疏松、OHCs細(xì)胞核深染(a2，中回)，但尚無(wú)顯著細(xì)胞缺失。P21時(shí)cCx26ko基底膜出現(xiàn)了大范圍的缺失，細(xì)胞排列紊亂(a3)，而野生型小鼠耳蝸基底膜細(xì)胞排列連續(xù)、整齊(b3)

圖2 P18cCx26ko小鼠基底膜染色結(jié)果(×400)

耳蝸的表面形態(tài)在熒光顯微鏡下出現(xiàn)明顯的變化。OHCs 核出現(xiàn)固縮(五角星所示)、染色濃集、體積變小、核碎裂成片斷化(箭頭所示)，甚至核缺失(星號(hào)所示)。其中中回(b)較底回(c)和頂回(a)改變明顯

3 討論

全國(guó)耳聾分子流行病學(xué)調(diào)查顯示, 我國(guó)大多數(shù)重度以上感音神經(jīng)性聾患者僅由為數(shù)不多的幾個(gè)基因突變所致[4,5]，其中, 最常見(jiàn)的致聾基因是GJB2 基因, 高達(dá)21.01% 的耳聾患者攜帶該基因突變，GJB2 基因突變?cè)陔p耳極重度聾組檢出率最高，達(dá)到 24. 67%[6]。目前GJB2突變導(dǎo)致耳聾的確切機(jī)制還不完全清楚。本文通過(guò)觀察GJB2基因條件敲除小鼠出生后不同階段的耳蝸PI和鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在P18時(shí)外毛細(xì)胞出現(xiàn)了典型的細(xì)胞凋亡改變，為進(jìn)一步研究凋亡在GJB2基因突變導(dǎo)致耳聾的作用機(jī)理提供了依據(jù)。

基因敲除小鼠是研究基因突變致病機(jī)制的良好工具。目前已經(jīng)有三種GJB2條件敲除小鼠模型報(bào)道[2,3]，盡管制作動(dòng)物模型所使用的技術(shù)方法不同，但對(duì)小鼠耳蝸形態(tài)和功能的影響卻很一致。三種敲基因動(dòng)物出生時(shí)耳蝸形態(tài)與野生型大致相同，提示GJB2基因?qū)τ谛∈蠖伒某錾鞍l(fā)育不起重要作用。光學(xué)顯微鏡下觀察耳蝸的組織結(jié)構(gòu)顯示[1]，cCx26ko成年小鼠耳蝸沒(méi)有明顯的膜迷路積水，血管紋細(xì)胞也沒(méi)有明顯的缺失，在聽(tīng)覺(jué)開始后可見(jiàn)支持細(xì)胞和外毛細(xì)胞死亡，但內(nèi)毛細(xì)胞形態(tài)改變不明顯。由于Cre基因的啟動(dòng)子不同，使上述三種小鼠GJB2基因敲除的時(shí)間不一致，導(dǎo)致制作的模型小鼠耳蝸在出生后發(fā)育中出現(xiàn)一些差異。研究顯示[2]Cx26loxP/loxP OtogCre小鼠從出生到P14耳蝸的形態(tài)與野生型均無(wú)明顯差異，從P14開始，Corti器細(xì)胞缺失從內(nèi)毛細(xì)胞的支持細(xì)胞開始，逐漸蔓延到外毛細(xì)胞的支持細(xì)胞，然后是外毛細(xì)胞以及其他細(xì)胞，但內(nèi)毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)完整，短聲ABR測(cè)試小鼠反應(yīng)閾提高約30 dB；此外在P17小鼠耳蝸中檢測(cè)到caspase 3表達(dá)陽(yáng)性，提示凋亡可能是cCx26ko小鼠耳蝸細(xì)胞死亡的主要原因之一。但是在Cx26loxP/loxP；Pax2Cre小鼠，GJB2基因在耳蝸出生后的發(fā)育中似乎起到了決定性的作用，光鏡下觀察到從 P9開始，耳蝸的Corti隧道和Neul氏間隙都未形成，細(xì)胞的死亡起始于 Claudius 細(xì)胞，然后是外毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，小鼠的聽(tīng)力損失也較為嚴(yán)重，短聲ABR測(cè)試顯示幾乎所有的頻率反應(yīng)閾均提高到70～90 dB SPL[3]。可見(jiàn)不同胚胎時(shí)間敲除GJB2基因，均可導(dǎo)致小鼠耳聾和耳蝸細(xì)胞的缺失，但產(chǎn)生的形態(tài)學(xué)改變和細(xì)胞缺失的順序存在細(xì)微的差別。本研究對(duì)Cx26loxP/loxP；Pax2Cre小鼠耳蝸掃描電鏡觀察結(jié)果提示外毛細(xì)胞缺失發(fā)生在P14和P21之間，但cCx26ko小鼠耳蝸毛細(xì)胞發(fā)生缺失的確切時(shí)間還不完全清楚[7]。因此本研究著重觀察了外毛細(xì)胞缺失與凋亡的關(guān)系，同時(shí)探討了外毛細(xì)胞缺失的時(shí)間，希望為今后進(jìn)一步研究細(xì)胞凋亡在GJB2基因突變致聾機(jī)制中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

PI是一種標(biāo)記死亡細(xì)胞DNA的熒光染料,應(yīng)用PI染色方法,可以對(duì)已經(jīng)死亡但還存在有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的凋亡和壞死毛細(xì)胞進(jìn)行定量分析。在PI染色的動(dòng)物耳蝸基底膜中，可以觀察到四種類型的毛細(xì)胞核，即正常、凋亡、壞死和缺失，毛細(xì)胞核固縮和深染色通常被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的典型形態(tài)學(xué)特征。但因耳蝸基底膜其它種類的細(xì)胞核也可以被PI染色，故在熒光顯微鏡下觀察毛細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化時(shí)應(yīng)注意與其它細(xì)胞核相區(qū)別。鬼筆環(huán)肽特異性標(biāo)記耳蝸毛細(xì)胞靜纖毛和表皮板的纖絲狀肌動(dòng)蛋白，缺失意味著毛細(xì)胞的死亡和溶解。異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽與PI聯(lián)合染色可以發(fā)現(xiàn)早期凋亡的毛細(xì)胞及觀察凋亡不同時(shí)期細(xì)胞纖毛和表皮板與毛細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化的關(guān)系[8]。

本文利用FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽和PI對(duì)野生型和敲基因小鼠耳蝸基底膜進(jìn)行染色,系統(tǒng)研究了小鼠出生后不同發(fā)育時(shí)期耳蝸Corti器外毛細(xì)胞的缺失方式和缺失時(shí)程，結(jié)果提示cCx26ko小鼠耳蝸外毛細(xì)胞的缺失方式為凋亡，在P18時(shí)外毛細(xì)胞發(fā)生了典型的凋亡改變，耳蝸Corti器的細(xì)胞損害在P14時(shí)可能已經(jīng)開始。這一結(jié)果為進(jìn)一步研究cCx26ko小鼠耳蝸細(xì)胞凋亡機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

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