王鴻涵 馮永 王行煒梅凌云陳紅勝蔣璐 門美超張華 李海波 劉亞蘭盧焰梅賀楚峰

1 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科(長沙 410008)； 2 耳鼻咽喉重大疾病研究湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3 中南大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

2006年的第二次全國殘疾人抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，我國現(xiàn)有聽力殘疾患者2 780萬人。嚴(yán)重的耳聾可以導(dǎo)致聾啞殘疾從而使患者喪失正常的社會(huì)交流能力，給其生活和工作帶來極大的障礙。統(tǒng)計(jì)顯示，在美國人群中新生兒先天性聾約占1‰[1]，大多數(shù)語前聾患者與遺傳因素有關(guān)[2]。根據(jù)患者是否伴隨其他癥狀或體征，遺傳性聾可分為綜合征型聾和非綜合征型聾；根據(jù)遺傳方式的不同又可以分為常染色體隱性遺傳、常染色體顯性遺傳、伴性連鎖性遺傳及線粒體母系遺傳等。其中常染色體顯性遺傳占遺傳性聾的15%左右，到目前為止，已經(jīng)成功克隆了24個(gè)常染色體顯性遺傳相關(guān)基因。本研究對一個(gè)遲發(fā)性非綜合征型常染色體顯性遺傳性聾家系的遺傳學(xué)特征進(jìn)行了詳細(xì)分析，并對其進(jìn)行了初步的基因突變篩查，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 病史及標(biāo)本采集 該家系的先證者于2011年3月就診于中南大學(xué)湘雅醫(yī)院耳鼻咽喉科門診。對參與研究的各家系成員充分告知相關(guān)事項(xiàng)，簽署知情同意書。采用問卷調(diào)查的方法詳細(xì)記錄受試者的病史資料，包括患者的一般信息、耳聾史、家族史、既往史(曾經(jīng)的疾病史、用藥史、噪聲接觸史、手術(shù)外傷史等)、體格檢查、聽力學(xué)檢查及相關(guān)特殊檢查情況。為排除耳部器質(zhì)性病變，對先證者(IV:22)和另外一名隨機(jī)抽取的患者(III:2)做了顳骨高分辨率CT掃描。納入研究的家系成員均抽取外周靜脈血5毫升(采血管含EDTAK2抗凝劑)，用于基因組DNA的提取。

1.2 基因組DNA的提取 對采集到的外周靜脈抗凝血用標(biāo)準(zhǔn)的酚-氯仿法提取基因組DNA(gDNA)，1×TE緩沖液溶解DNA后取出2 μl以NanoDrop 1 000(v 3.7.1)分光光度計(jì)(Thermo Scientific Co., DE, USA)檢測濃度，并根據(jù)A260/A280的吸光度比值判斷gDNA的純度，得到的gDNA樣品A260/A280的比值均在1.8～2.0之間。根據(jù)所測濃度，用1×TE緩沖液稀釋gDNA樣品至工作濃度50 ng/μl，分裝-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 候選致病基因的篩查 經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)[3]，選取臨床表型相似且較常見的常染色體顯性遺傳性聾(DFNA)致病基因GJB2 (NM_004004.5)、GJB3(NM_024009.2)、 KCNQ4 (NM_004700.3)、COCH (NM_004086.2)和EYA4 (NM_004100.4)作為候選致病基因。

在美國國家生物技術(shù)信息中心的Genbank數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中查閱以上候選基因標(biāo)準(zhǔn)序列后使用加拿大生物研究所提供的primer3在線引物設(shè)計(jì)軟件(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)的引物確保PCR擴(kuò)增產(chǎn)物涵蓋所有外顯子編碼區(qū)及側(cè)翼內(nèi)含子序列，所有引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

以先證者外周血為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為：Premix Ex Taq (Hot Start Version) 10 μl(寶生物工程有公司)，基因組DNA 2 μl(50 ng/μl)，正反向引物各1 μl(50 ng/μl)，補(bǔ)三蒸水至20 μl。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性1 min，98 ℃變性10 sec，65 ℃退火30 sec，72 ℃延伸1 min，以后每2個(gè)循環(huán)降低2 ℃直到降至57 ℃，共10個(gè)循環(huán)，把55 ℃作為“touchdown”退火溫度，98 ℃變性10 sec，55 ℃退火30 sec，72 ℃延伸1 min，共20個(gè)循環(huán)，最后充分延伸10 min，4 ℃保存。使用的儀器為PE9600 PCR儀(Perkin Elmer公司)。PCR產(chǎn)物經(jīng)蝦堿性磷酸酶和限制性核酸外切酶酶切純化，純化后的PCR產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳驗(yàn)證其特異性，符合要求的樣本使用ABI 3730測序儀直接雙向測序，測序結(jié)果使用DNASTAR-Lasergene SeqMan Pro軟件與GeneBank數(shù)據(jù)庫中查得的序列進(jìn)行序列比對。

2 結(jié)果

本家系所有成員均為湖南籍，漢族。調(diào)查的78人中22人發(fā)病(其中6人已故)，年齡最小的患者為9歲(V:13)，大部分患者臨床表現(xiàn)基本一致，主訴大約在9～25歲時(shí)覺雙耳“嗡嗡樣”耳鳴，隨后出現(xiàn)聽力下降，聽力下降的程度逐漸加重，無耳溢、眩暈等。除耳聾家族史外無其它家族性疾病，無明確的氨基糖苷類抗生素等耳毒性藥物應(yīng)用史，無長期噪聲接觸史，全身及耳鼻喉專科體格檢查無明顯異常發(fā)現(xiàn)。純音測聽示早期以高頻聽力下降為主的感音神經(jīng)性聾，隨著發(fā)病時(shí)間的延長，慢慢發(fā)展為全頻下降的重度或者極重度感音神經(jīng)性聾(判斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)WHO1997年公布的聽力損失程度分級標(biāo)準(zhǔn))，部分患者的聽力圖見圖1。先證者和另外隨機(jī)抽取的一名患者的顳骨高分辨CT檢查示內(nèi)耳及中耳均無明顯器質(zhì)性病變(圖2)。根據(jù)受試者的一般信息及檢查結(jié)果，用Cyrillic軟件(2.02 Version)繪制了家系圖(圖3)。

該家系連續(xù)5代發(fā)病，男女發(fā)病比例8:14(女性患者較男性多是因?yàn)榕栽诘?代占總?cè)藬?shù)的絕大多數(shù))，父母一方患病，其子女均可能受累，父母雙方均表現(xiàn)正常，子女也均表現(xiàn)為正常，男女發(fā)病者占總體性別的比率均等，符合常染色體顯性遺傳的特征。體格檢查及影像學(xué)未見患者伴隨其他疾病，可以認(rèn)為該家族為非綜合征型聾。出生時(shí)均表現(xiàn)為正常，到一定年齡之后起病，這符合遲發(fā)性聽力損失的特征。

通過對家系成員外周血基因的直接測序結(jié)果與GeneBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對，GJB2、GJB3、COCH和EYA4這4個(gè)基因均無異常發(fā)現(xiàn)，僅在KCNQ4基因中發(fā)現(xiàn)了3處雜合的堿基改變(圖4)，其中在第5和第14外顯子編碼區(qū)的兩個(gè)突變位點(diǎn)c.777 T>C(為已報(bào)道的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs:4660468)和 c.1986 C>G(未見報(bào)道)均為同義突變，沒有導(dǎo)致氨基酸的改變，IVS4+14G>C也是已經(jīng)報(bào)道的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(rs:2361660)。對家系其他患者和正常人檢測這三個(gè)位點(diǎn)的突變情況，沒有發(fā)現(xiàn)這些堿基改變與臨床表型有共分離現(xiàn)象。

圖1 家系部分成員的純音測聽圖

圖2 家系成員IV:22(a)和III:2(b)的顳骨高分辨率CT圖像

□正常男性;○正常女性;■患者男性;●患者女性;先證者;/已故圖3 一個(gè)湖南籍非綜合征型常染色體顯性遺傳性聾大家系系譜圖

圖4 KCNQ4基因在該家系中的堿基改變情況

3 討論

非綜合征型遺傳性聾目前仍被視為單基因遺傳病，其致病原因往往是由于某個(gè)基因的堿基序列發(fā)生了改變。目前人們已經(jīng)成功克隆出非綜合征型聾責(zé)任基因約60個(gè)，其中DFNA25個(gè)，常染色體隱性遺傳性聾基因(DFNB)39個(gè)，伴X連鎖遺傳性聾基因(DFNX)3個(gè)，其中GJB2、GJB6、MYO6、MYO7A、TECTA、TMC1、COL11A2這7個(gè)基因既可引起DFNA又可引起DFNB[4]，線粒體突變也是導(dǎo)致感音神經(jīng)性聾的常見原因。目前認(rèn)為GJB2(connexin-26，Cx26)是最常見的遺傳性聾致病基因，它既可以導(dǎo)致常染色體隱性遺傳性聾(DFNB1A)，也可以導(dǎo)致常染色體顯性遺傳性聾(DFNA3A)[5]。GJB2已有百余種突變方式被報(bào)道，其中9種突變方式可以導(dǎo)致常染色體顯性遺傳性聾，患者的聽力損失程度也從輕度到極重度不盡相同，遲發(fā)性者可表現(xiàn)為高頻聽力損失為主的下降型聽力曲線，往往呈進(jìn)行性加重[6]。GJB3和KCNQ4同位于DFNA2座位上，前者最早由我國學(xué)者夏家輝院士克隆于中國的兩個(gè)耳聾家系中，家系成員中患者的聽力曲線呈下降型[7]；后者已在數(shù)個(gè)家系中發(fā)現(xiàn)突變，患者開始時(shí)多為高頻聽力損失，隨年齡增長逐漸累及全頻，聽力損失程度逐漸加重，發(fā)病年齡多在10～20歲之間[8,9]。COCH于1998年被鑒定為耳聾致病基因[10]，并在多個(gè)耳聾家系中發(fā)現(xiàn)存在突變，被報(bào)道的突變位點(diǎn)有12個(gè)，患者表現(xiàn)為20歲左右起病，耳聾進(jìn)行性加重，直至全聾，但該基因?qū)е碌亩@多伴隨前庭功能障礙癥狀[11,12]。2001年科學(xué)家們在兩個(gè)互不相干的遲發(fā)性常染色體顯性遺傳性語后聾家系中發(fā)現(xiàn)了EYA4基因缺陷，患者表現(xiàn)為高頻及中頻聽力損失[13]，隨后在其他的幾個(gè)家系中也發(fā)現(xiàn)了EYA4基因突變[14～16]，目前報(bào)道有6種突變方式。

與上述DFNA家系相似，文中家系成員中患者的臨床表型也表現(xiàn)為遲發(fā)性語后聾，由最初的高頻聽力下降發(fā)展為全頻聽力損失。但該家系又有自己的特點(diǎn)，表現(xiàn)為聽力損失之前先出現(xiàn)“嗡嗡樣”耳鳴，之后耳鳴伴隨聽力下降持續(xù)存在。家系成員之間表型的高度一致性說明他們之間存在共同的遺傳基礎(chǔ)，很可能是由于相同的遺傳學(xué)缺陷導(dǎo)致的。

本研究通過對候選致病基因的突變篩查，僅在先證者KCNQ4基因的第5和第14外顯子編碼區(qū)以及第4內(nèi)含子剪接區(qū)發(fā)現(xiàn)了堿基序列的改變，其余基因序列的測序結(jié)果均與NCBI GeneBank數(shù)據(jù)庫中公布的序列一致。KCNQ4基因突變最先在一個(gè)法國家系中被鑒定為耳聾致病基因[17]，隨后在比利時(shí)、美國、荷蘭、日本等多個(gè)國家的耳聾大家系中被報(bào)道存在移碼、無義等形式的突變[18～21]。目前，共發(fā)現(xiàn)KCNQ4的耳聾相關(guān)突變位點(diǎn)16個(gè)，其中錯(cuò)義突變13個(gè)，剪接位點(diǎn)突變1個(gè)，微小缺失2個(gè)。KCNQ4基因 位于人染色體1p34上，編碼一種K+通道蛋白，它對維持內(nèi)耳功能及內(nèi)環(huán)境的K+穩(wěn)態(tài)起著關(guān)鍵作用[22]。

本研究根據(jù)患者的表型推測，對有可能致病的幾個(gè)候選基因通過PCR擴(kuò)增直接測序的方法初步進(jìn)行耳聾致病基因突變篩查，結(jié)果僅發(fā)現(xiàn)家系中先證者KCNQ4基因編碼區(qū)的兩處堿基改變均為同義突變，剪接區(qū)的堿基改變也為已經(jīng)報(bào)道的良性多態(tài)。同時(shí)對家系中其他患者進(jìn)行突變檢測以后，發(fā)現(xiàn)這些堿基改變均沒有和疾病發(fā)生共分離，說明KCNQ4可能不是這個(gè)家系的致病基因。下一步將運(yùn)用連鎖分析，必要時(shí)結(jié)合外顯子組測序的方法對該家系患者的致病原因進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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